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从1442例新冠病毒全基因组图谱分析：华盛顿主簇是新冠病毒的根簇吗？
首先，再次说明，小编最近几篇文章所引用的图片和资料全部来自“下一个病毒株”网站的数据库GISAID（链接：https://nextstrain.org/ncov/zh），文章引用图片上红色的字是小编为了帮助大家理解而添加上去，资料还是来自网站。截止到北京时间2020-03-26中午之前，已上传SARS-CoV-2病毒全基因组数据有1442例，是由来自分布全球各地的实验室各自独立上传的，其中来自荷兰、美国、中国、英国等地的实验室上传的数据量比较多。
2月22号，中科院西双版纳热带植物所郁文彬等人率先利用该数据库的基因组数据，来分析SARS-CoV-2的发育进化树，但当时他只有93条数据。3月初，北京大学的陆剑研究员与中科院巴斯德研究所的崔杰研究员，利用103株已有病毒信息，“分析发现”新冠病毒已经存在两个亚型，他们文章在线登在中国科学院主办的《国家科学评论》。
郁文彬等人文章把美国“首例”（即2020-1-19日采样的华盛顿州西雅图1号：USA/WA1/2020）单倍型标记为H38，并与蝙蝠RaTG13对比，说可能是“古老”类型，如下图右上角示意。
如下图，郁文彬文用黄色虚线画出从蝙蝠经西雅图1号H38、再传到武汉H3的路径。但是根据传播学假设进化路径和推断进化路径都是反向的，是从单倍型H3传播给H38。因为从传播学上讲，这个传染关系是比较清楚的，患者是一个男性华人，有武汉暴露史，从武汉探亲返回西雅图，于2020-01-19日采样确诊。
而陆剑和崔杰文章确认了2019新冠病毒存在两个亚型（L和S），实际上，已经否定了郁文彬文中关于西雅图H38和深圳H13是“古老”单倍型的假定，它们只不过是S型分支的下游。随着数据量增大，2019新冠病毒的根部在哪里已经显而易见，不言而喻。随着新冠病毒北欧族的爆发以及来自欧洲数据样本的大量增加，2019新冠病毒系统进化树呈现三大簇+众多小分支结构。为了方便大家记忆和理解，小编把三大簇分别命名为：欧洲簇、环太（平洋）簇和全球簇。环太簇实际就是原来小组S型，全球簇实际就是原来的大组L型。（1442例2019新冠病毒系统进化矩形图）
郁文彬等的文章被某些自媒体添加油加醋以后，就演变成了“病毒来自美国”的谣言被广泛传播，很多人深信不疑。实际上在郁文彬等人的文章中，他们并没有给出这个结论，只是给出了假设进化路径、推断进化路径和与蝙蝠对比假设路径多种可能性。随着数据库基因组数据量的增大，郁文彬的蝙蝠假设路径显然是不成立的。所以，小编呼吁郁文彬能够公开站出来澄清问题。
在上篇文章中1111例全球新冠基因组谱系图新变化，又是几百个留言（大约有1/4是支持欣赏态度、1/2是提出各种质疑或讨论问题的、1/4是各种无理漫骂的，但共只能显示100个）。其中有一些是专业人士的留言。有一位叫THT的网友仍然坚持说，郁文彬的方法是正确的，西雅图大群样本（华盛顿州主簇）就是“更古老”的。这里全文显示在这里：就拿你说的USA/WA1/2020（样本1）样本来说吧，该样本是西雅图大群的根，也就是西雅图大群都和该样本相关，从网站无根树上看，Wuhan/WH04/2020（样本2）样本应该是位于其更上层的根，这是武汉的样本，接下来就是网站上使用的参照样本Wuhan-Hu-1/2019（样本3），如果其作为起源的话，可以简单的将这三个样本的全基因组核酸序列进行同源比对，比对工作我也做了，结果显示三个样本在8785位的核苷酸1和2都为T，3为C；18065位1为T，2和3均为C；28146位1和2都为C，而3为T。我们可以推导一下样本1如何从样本3演变，首先样本3需在8785和28146位经两次突变变成样本2，接下来样本2需通过18065位再次突变成为样本1。但如果反过来推导也成立，即样本1通过1个碱基突变成为样本2，再通过两个碱基突变成为样本3。 假设WA1病人是在西雅图入境时被当地传播但未检测的病人传染，因有武汉暴露流行病史而被检测了，则能代表本地的感染情况，也许早期有与西雅图大群遗传型相同的美国病人将病毒带到武汉而该病人因各种原因没被发现，最后经变异成为Hu-1病毒遗传型也是有可能的。你文章里说郁文彬犯了错误是流行病传播时间上的问题，但前提是美国知道该病，且能正确的检测出该病，我的推论是实际上新冠在武汉之前已在美国流行，而西雅图大群是一个早期的分支，证明这点可以带入郁文彬用的参照，蝙蝠的冠状病毒基因组序列（bat-RaTG13-CoV，序列号EPI_ISL_402131），该序列与上述三个样本有1千多碱基的不同，但不同处三个样本都是一样的不同，除了我上面说的三个位点，在这三个位点上WA1与蝙蝠样本完全一样，而两个武汉样本分别与蝙蝠样本序列有一个和两个碱基的差异，这就说明了WA1样本更接近蝙蝠样本，更古老，因此西雅图大群样本更古老，郁文彬的方法完全是正确的，除非病毒起源不是蝙蝠或蝙蝠携带的病毒是人传的，否则从遗传进化上就说不过去。目前纽约的样本还只有4个，等将来纽约的样本更多了还可以进一步比较，可能会再出现另外的相比武汉样本更古老的大群。
他说的什么意思呢？我来图解一下。他也做了三个样本的基因组比对，分别是1个西雅图（USA/WA1/2020）和两个武汉（Wuhan/WH04/2020、Wuhan-Hu-1/2019）样本。这三个样本在三个位置（8785、18065、28146）存在碱基不同。用两个不同的突变方向都可以解释通。
通过与蝙蝠冠状病毒RaTG13基因组比较，他说：这三个样本的这三个位置都与蝙蝠不同。但除此以外，武汉04和湖北1号还有一两个碱基与蝙蝠不同。而西雅图1号与蝙蝠更接近。但首先问题是：SARS-CoV-2病毒是不是就是来自蝙蝠冠状病毒RaTG13？前提条件无法证明成立，自然推论就难以成立。
而GISAID数据库显然是采信第二种即从武汉向西雅图方向突变。在数据库中，湖北1号突变数为0，武汉4号突变数为2，西雅图1号突变数为3。下面小编从无根树的逻辑上分析为什么GISAID数据库显示是对的。下面就来分析华盛顿州主簇根部。
网站给出的环太簇样本矩形图和分布图如下，现在已有465例样本。 （截止3月26日，465例环太簇系统发育矩形图）
（截止3月26日，465例环太簇分布传播图）
根据网站展示信息，环太簇最早的一例样本就是武汉4号（Wuhan/WH04/2020），来源实验室是中国人民解放军中央战区总医院，患者是一位39岁的男性，于2020年1月5日采样。
按突变显示，环太簇根部有一些突变步数为2的样本组成。以下是该簇根部已有的同基因组样本，有武汉、台湾、澳大利亚、上海 、广东、比利时、新加坡等地的样本。
- 2020-01-05,Wuhan/WH04/2020
- 2020-01-18,Wuhan/HBCDC-HB-03/2020
- 2020-01-24,Taiwan/3/2020
- 2020-01-24,Australia/NSW01/2020(有湖北暴露史)
- 2020-01-30,Shanghai/SH0013/2020
- 2020-01-30,Shanghai/SH0024/2020
- 2020-01-30,Shanghai/SH0043/2020
- 2020-01-30,Shanghai/SH0065/2020
- 2020-01-30,Guangdong/2020XN4459-P0041/2020
- 2020-01-31,Taiwan/NTU01/2020
- 2020-02-03,Belgium/GHB-03021/2020
- 2020-02-19,Singapore/14/2020
- 2020-02-25,Guangzhou/GZMU0044/2020
- 2020-02-25,Guangzhou/GZMU0048/2020
- 2020-02-25,Guangdong/GDSZ202015-P0019/2020
（截止3月26日，465例环太簇按突变辐射图）
截止3月26日，华盛顿主簇样本有329例。按突变显示的辐射雷达图如下：（329例华盛顿主簇进化按突变辐射图）
根据网站显示，在华盛顿州主簇根部已有三例突变步数为3的同基因组样本，分别是西雅图1号、福建8号和杭州8号。- 2020-01-19,USA/WA1/2020(有湖北暴露史)
- 2020-01-21,Fujian/8/2020
- 2020-01-26,Hangzhou/ZJU-08/2020
另外在华盛顿州主簇根部附近位置的已有样本还有马来西亚、重庆和广东的样本:- 2020-02-20,Malaysia/MKAK-CL-2020-6430/2020,突变4
- 2020-01-21,Chongqing/YC01/2020,突变5
- 2020-02-07,Guangdong/GD2020234-P0023/2020,突变5
- 2020-02-28,Guangdong/FS-S30-P0052/2020,突变5
用按日期顺序显示的辐射雷达图和矩形图再展示截止到3月26日的华盛顿簇和其根部情况：
（329例华盛顿主簇进化按时间辐射图）
（329例华盛顿主簇进化按时间矩形图）
无根树是最客观的，下图显示截止到3月26日，按突变显示的环太簇无根树。可以看到华盛顿州主簇的根部（以西雅图1号为代表）与环太簇根部(以武汉4号为代表)以间隔1步突变相连，其暴发节点与环太簇根部相距3个突变距离。（需要说明一点是：在无根树上，由于在同一个突变点位置上可能有很多基因组相同的样本重叠在一起，网站显示是最新提交的一个数据在上面。）（截止3月26日，465例环太簇按突变无根树）
下图是已有全部1442例样本的新冠病毒按突变显示的无根树，可以看到在三个方向的大簇内都有华盛顿州的分支。位于欧洲主簇内的华盛顿次簇是由法国人或荷兰人传播的，也是显而易见。环太簇根部与全球簇相距2个突变距离。欧洲主簇根部与全球簇根部有3步的突变距离。（需要再做说明的是，无论是欧洲簇还是华盛顿簇只分别表示为欧洲和华盛顿州最大的一个簇，而不是当地唯一簇。）现在全球簇根部突变被认为是0，主要是中国的样本，包括湖北1号。
（截止3月26日1442例2019新冠病毒进化无根树）
下面根据无根树进行逻辑分析：为什么华盛顿主簇不可能是“古老”根部。- 野生动物做外源参考的不确定性：由于现在仍然没有确切证据能证明新冠病毒是通过野生动物（蝙蝠、穿山甲、蛇、竹鼠等）的冠状病毒突变而来，用蝙蝠等冠状病毒做外源参考，是不能保证正确性的。
- 有明确传播关系的样本可以做明确的突变方向参考：由于早期样本都可以追溯到武汉，有大量样本的传染源是很清楚明确的。如已知传染关系从A传到B，分析A和B的基因组，如有突变，就可以确定突变方向和上下游关系，准确绘制系统发育进化树。即采样日期+传染关系能100%锁定突变方向。可以相信GISAID数据库分析是正确的。
- 欧洲主簇与华盛顿主簇不能直接相连导致暴发时间问题：欧洲主簇和华盛顿主簇根部都有通过中国的样本连接到全球簇上。而欧洲主簇与环太簇(含华盛顿主簇)不能直接相连，这表明从华盛顿主簇无法直接发育出欧洲主簇。反之亦然，不能从欧洲主簇直接发育成华盛顿主簇（华盛顿次簇是直接从欧洲簇发育的）。从全球簇爆发（中国）到欧洲主簇暴发时间相隔一个多月。欧洲主簇与华盛顿主簇暴发都差不多是在与全球簇距离4个突变时暴发，如果病毒根部是从华盛顿主簇起步，那么到欧洲主簇爆发时则需要至少8个突变距离，则欧洲主簇暴发应该晚于华盛顿主簇2个多月。但实际上不是这样。这两个簇暴发前后间隔时间很短，都是在3月中旬左右，这与这两个簇暴发突变距离与全球簇距离都是4等距离是一致的。欧洲主簇暴发时间还稍稍在前，而被认为“古老”的华盛顿主簇暴发反而稍在后。这是不符合逻辑的，表明华盛顿主簇不可能是“古老”根部。
- 华盛顿主簇不能与其他本地簇直接连接：从传播逻辑讲，如果华盛顿主簇是古老根部，那么其他华盛顿簇分支以及美国许多州的分支都应该先直接连到华盛顿主簇上。但实际上我们可以看到无论是华盛顿州次簇，还是从全球簇直接发育出来的华盛顿3簇，以及其他众多的华盛顿小分支，没有一个直接连到华盛顿主簇上。美国其他州的分支也同样都不是从华盛顿主簇发育出来的。如果华盛顿主簇是古老根部，不可能发生这种现象。
- “古老簇”应具备中心特征：如果作为“古老”根部，它应该能体现主要分支都与它相连的特征。但华盛顿主簇没有这个特征。从矩形图看，华盛顿主簇只有3个比较新的分散的澳大利亚样本，显示最近从华盛顿州向澳大利亚的传播。从去年12月开始迄今，全球疫情已经传播了4个月，而从华盛顿簇只扩散发育了零星的几个澳大利亚样本，所以它只可能是一个很年轻的本地社区暴发猛烈的簇，而不可能是古老簇。
但问题还没有结束，还有一个问题需要讨论。关于荷兰独立支的问题，其因为与全球簇根部很近，在第一时间，小编也觉得这里可能会有什么问题线索。一个叫Ray的网友，自称是进化生物学家，他再结合网络“谣言”，在上一篇文章后留言认为这里“有关联”。如下全文显示：本人是進化生物學家，在 Cell , Evolution 等期刊發表進化生物學相關的文章。你對該數據的解讀屬於誤導！請你立即撤回！武漢先發現這個病毒存在，當然會在大支基部，但是按照目前根的位置，根本不能說明就是武漢起源。其原因就是因為荷蘭獨立支。它是在比較靠近根部的位置分化的，而後分化的一支只包含了三個上海的樣本，卻包含了大量的歐美樣本。這個特性，實際上說明該支祖先極為可能是在歐洲。而且小支和大支分化時間最早是去年10月13日，那如果起源是武漢，就必須是武漢先傳去歐洲（留下荷蘭獨立支），分化後再傳回上海，其餘留在歐洲繼續分化。但是如果真的如此，那麼荷蘭獨立支之前應該還能找到分化出來武漢的屬於小支的樣本，但是目前還沒有看到小支基部這裡存在武漢樣本！我預測，如果把去年美國的樣本拿來測，就會出現在小支的基部，甚至是全樹和外群連接的基部！因為美國和歐洲聯繫特別緊密。而且最近傳言的 Maatja Benassi ，和美國被關閉的 fort Detrick 研究所有關，她參加了武漢軍運會（10月18到28日），然後又去了荷蘭見親戚（Maatja 就是荷蘭名字）。所以一切都吻合了。美國為什麼現在不批准測去年的流感樣品，你知道沒有！
小编认为既然是搞科学研究的，那就应该用科学证据说话，而不应该用牵强附会的联想说话。从科学角度讲，当小编了解到2019新冠病毒可能存在突变休眠这个问题后，这个问题也就不再是个问题。上海到现在还能检测到突变为0的病例。那携带突变为0的病例走遍全世界，就可能把原来根部类型的基因组带到全世界。所以荷兰独立支离根部很近并不难理解。实际上突变为0的外国样本已经出现，包括有英国、美国加州的样本。同样利用科学逻辑，这些晚期出现的零星样本不可能是“古老的传播源”。
本文仍然是一篇纯科普文。不想在这主文里说过多与科普无关话题。外交部发言人耿爽和崔天凯大使，都说过要尊重科学。这个网站数据来自全球众多实验室的贡献，是最科学与公正的。他们实际上已经给出了十分明确的答案。小编也只是想做一个桥梁，把目前最新科学结果转告给大家，做到心中有数。有人嘲讽说，你为啥不发表文章呢？因为，这些数据都是别人上传分享的，分析结果也都是现成的，自己没有什么新的东西，发论文又有何意义呢？当然，也许必要的时候我也会写论文的。
绝大部分留言不是关注科普本身。而是带着谣言来质疑你，甚至各种无端谩骂。但请大家相信，小编是一个地道的中国人，做一切事，说一切话，都是站在中国立场，站在中国人利益立场说话。不停制造谣言，不会给国家和中国人带来任何好处。谣言之于国家，只会带来误解、对抗与仇视。对于国人自己，形象被自毁，给世人不信任感。就比如，如果我是公司老板，我绝对不会雇佣这样的人：没有担当、没有责任感，因恐惧担责，遇事就甩锅赖他人。实际上，迄今，世界上从未因为发生疫情而要求赔偿的先例。又比如，非湖北的外省人有没有找湖北人要求赔偿？因为我们都知道湖北人也是受害者！我们不会也不可能这样做！还有人说你为什么只批评中国，不批评美国？小编当然也有批评欧美国家，比如参考：对新冠肺炎死亡率低估是让欧美国家付出代价原因之一。有人说你支持“中国病毒”，你是汉奸。实际上小编多次表示反对，并对外交部发言人赵立坚用“病毒起源地方未定”不当反击而提出不同意见，指出应该用遵守世卫规则来要求。看到新闻报道说，特朗普已经表示不再把COVID-19病毒与中国或武汉关联。这是一个积极的信号。
当然，某些地方总存在一些极端的人，比如有消息说美国佛罗里达州有律师要起诉中国，指控中国没有更快报告与控制。但这些人不会得到任何支持。还看到一个消息说，一个武汉律师要起诉美国，指控“美军把病毒带到了武汉”。有媒体记者采访他时，他说是配合外交部对美国“冲锋在前”之举。结果他被“主管部门领导”约谈了。有网友说他这是“高级黑”啊，“愚民宣传这样搞下去，接下来只有战争了！”
文章来源于鹰蛇之夏，作者兵策儒剑
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发表于 2020-4-6 09:49:00
