新冠：核酸阴性还不行，必须抗体阳性

admin

近日，《中国新闻周刊》就北京开展新冠检测相关问题专访了美国对外关系委员会全球卫生高级研究员黄严忠。

黄严忠：让老百姓产生“核酸检测阴性是通行证”这样的想法是错误的，会让人对病毒掉以轻心。首先，核酸检测本身就有至少20%的假阴性，存在漏检问题，比进行血清抗体检测得到的感染率低。武汉5月到6月对全市990多万常住人口进行核酸检测，检出无症状感染者300名，检出率为0.303/万。在这之前，中国疾病控制中心在武汉启动了居民新冠病毒血清流行病学抽样调查，抽样人次达1.1万，有媒体报道，该抽样调查有5～6%的取样者出现抗体阳性。这是另一个让我疑惑的地方，为什么推核酸检测，而不是血清抗体，可能因为血清抗体检测需要采血，技术上不便于大范围、全面筛查。此外，从武汉的“十天大会战”结果来看，可能更多的是想让老百姓吃个定心丸，如果测出5～6%抗体阳性，则意味着50～60万人被感染过，老百姓不清楚其中缘由，可能被吓到，不利于社会稳定，不利于复工复产。其次，核酸检测的有效期只有几天，只能证明当下没有被感染，检查结果阴性又怎么样呢？出去还是要戴口罩，还是会担心被别人感染，到时候怎么办？再筛查一次吗？如果真的把检测阴性当做通行证，就不会特别小心，在预防上不重视，某种程度上会鼓励病毒的传播。按照科学的思维模式，应该是抗体检测阳性是通行证，这说明感染者已经好了，且不会传染给别人。我有一个护士朋友，之前在新泽西抗疫前线时，她自己没有特别的感觉。疫情稳定后，她回家办公，检测出抗体阳性，我们都恭喜她，可以横着走了，因为抗体阳性、核酸阴性，就不会传染给别人。但国内现在把核酸检测阴性结果当成了通行证，这是科学教育出现了偏差。

看到这里，我们还是有必要复习一下，国家卫生健康委临床检验中心李金明教授关于新冠核酸检测和抗体检测的专业回答。

2019-nCoV核酸检测结果为阴性，可以作为判断患者未被感染的诊断依据吗？
李金明教授：这个问题问得很好，既然病毒核酸检测阳性可作为患者确认的标准，那如果病毒核酸检测结果为“阴性”，是不是也可用来判断患者没有被感染病毒呢？答案是：不能。因为不管是什么样的病原体核酸检测，假阴性都是一种绝对的存在，也就是说一定会有假阴性。通常由下述原因所致：（1）患者体内病毒载量因素，也就是病毒在人体内的复制量尚未达到可以检测到的程度，所采集的标本中没有足够量可供用于检测的病毒；（2）所使用的病毒核酸检测试剂分析敏感性不够高；（3）实验室没有严格遵循基因扩增检验实验室的质量管理（合理的分区、有能力的检测人员和严格的质量管理体系）；（4）样本质量因素，也就是样本的采集是否符合规范要求，其标本是否采集到了含有病毒的细胞。

那又如何尽可能避免临床医生所关注的临床层面上的“假阴性”呢？
李金明教授：要想尽可能避免临床医生所关注的临床层面上的“假阴性”，首先要解决的是“被感染者的细胞中有一定量的病毒、采集标本时采集到含有病毒的细胞”这两个环节的问题。也就是要解决俗话所说的“巧媳妇难为无米之炊”的问题。

（1）被感染者的细胞中有达到所用试剂盒可检出量的病毒：患者受到病毒感染后，病毒通过鼻腔和口腔进入到咽喉部，再到气管和支气管，进而到达肺泡，感染者会经历潜伏期、轻度症状、再到严重症状的过程，不同病程阶段以及机体不同部位（鼻咽部、口咽部、气管、支气管、肠道、尿路和血液循环等）存在的病毒量有所不同，是因为这些部位细胞所含病毒受体占比不同所致。有研究表明，患者感染后，在出现疾病症状前，在上呼吸道细胞中即可存在高浓度的病毒，出现症状后，反而是降低了很多。发现下呼吸道标本如痰的病毒浓度是远高于鼻咽部（5倍以上），鼻咽部又高于口咽部（5倍左右），鼻咽部样本检测的阳性检出率是口咽部的两倍左右；也有约接近1/3的患者的粪便标本中可检出病毒，而血液和尿液中极少能检出。总之，从临床的实际角度看，可按下述次序选择病毒核酸检测样本，即深咳痰、鼻咽部、口咽部和粪便等。因为操作的方便性和患者的接受程度，目前临床最常用的标本是口咽部拭子，其次是鼻咽部拭子，而在某些患者中，口咽部或鼻咽部细胞中病毒量较少或极低，如果只取口咽部或鼻咽部标本检测，病毒核酸就检测不到。尽管肺泡灌洗液更容易检出核酸，由于其操作的复杂性，难以作为常规采样方法。此外，新冠肺炎患者通常为干咳，痰标本也较难得到。因此，一个特定的疑似感染的患者，不同的病期，在不同的身体部位出现病毒的浓度会有差异，如咽部没有，却可能粪便中有，如能同时或在疾病过程中的不同时间采取上述多种标本进行检测，会有助于“假阴性”的避免。

（2）标本采集时要采集到含有病毒的细胞：理论上说，目前的注册试剂都包含检测人细胞或外源性的序列“内参（internal control）”，如果是人源性的内参（如含有一个单链RNA分子的RNase P）。则其可以监测是否采集到足够量的细胞。但是，采集部位不当，如采集口咽拭子时，采集深度不够；采集鼻咽拭子没有采到鼻腔深处；采集痰时，并没得到真正的痰等，可能采集到的细胞绝大部分都是不含病毒的细胞，即可能造成“假阴性”。通过加强对标本采集人员的培训，可以在很大程度上解决该问题。

如上所述，临床层面上的核酸检测“假阴性”也是无法完全避免的，那是不是我们就一点别的办法就没有了呢？不是的。目前一个行之有效的办法，就是在患者病毒核酸检测阴性时，但临床又疑似为新型冠状病毒感染时，可以补充新型冠状病毒特异抗体检测。
为什么呢？原因如下：因为抗体是机体感染病毒后，由体液免疫应答所产生。通常，血液中最早可检出是IgM抗体，其后是IgA，再后是IgG抗体，IgG抗体出现后，其滴度还会有一个持续增高的过程，并在血液循环中保持较长时间存在；IgM和IgA抗体在IgG抗体出现后，有一个共存的过程，但其滴度会逐步下降，直接消失。IgG抗体中有相当部分是针对病毒的刺突蛋白（亦即S蛋白）的，是病毒的中和抗体，可阻止病毒对细胞的持续感染，这种抗体的出现，是患者康复向好的标志。因此检测特异IgM/IgG抗体也可以明确患者是否“近期或既往感染过新型冠状病毒”，有助于核酸检测阴性但临床上疑似患者的确诊。而且抗体检测对临床实验室的操作要求相对于核酸检测要低，可以快速、大量检测，且可以在基层实验室完成。但要说明的是，特异抗体检测阳性不能像病毒核酸检测阳性一样作为病毒感染的“金标准”，因为抗体检测容易受到血液标本中的一些干扰物质的存在而出现“假阳性”结果，所以抗体检测必须采用IgM和IgG同时检测且通常需多次（2次以上）动态检测来确认，IgM/IgG初次检测可能出现的结果有IgM（+）/IgG（-）、IgM（+）/IgG（+）、IgM（-）/IgG（+）和IgM（-）/IgG（-）四种模式，可按图1所示流程进行检测以判断患者是否为急性或近期感染。

国内有研究表明，最初湖北疫区因为病毒核酸检测始终为阴性而采用临床诊断的病例，19例样本中有16例为IgM阳性，18例为IgG阳性，这说明这些患者绝大部分为IgM和IgG同时阳性。此外，国内的另一研究表明，27例患者在发病后20天内均发生了IgG或IgM血清转换，二者发生血清转换时间中位数均为发病后13天，其中7例患者IgM较IgG先发生转换，10例患者IgM和IgG同时转换，10例患者IgM较IgG晚发生转换。无论IgM还是IgG发生血清学转换均可作为近期感染SARS-CoV-2的确诊标准，发病后20天内若核酸和抗体均未检出，基本可以排除患COVID-19的可能。70%以上的患者在急性反应期会发生IgG由阴性向阳性或出现滴度4倍以上的升高。


图1. IgM/IgG用于判断急性或近期感染的动态检测及判断方法

2019-nCoV 的IgM和IgG抗体检测假阳性的原因？
李金明教授：特异IgM和IgG免疫测定假阳性可能会有以下几个方面的原因，一个是试剂盒原材料即抗原的选择的问题，其是否与SARS-CoV或其亚属冠状病毒有交叉反应；第二个方面，则是抗体检测方法学所涉及到的试剂盒阳性判断值（Cut-off value）的设定，一些处于阳性判断值附近的弱阳性结果，很可能是假阳性；其三是患者标本中存在导致免疫测定假阳性的内源性或外源性干扰物质。

SARS-CoV-2与SARS-CoV的S蛋白的ACE2受体结合部位存在交叉反应。冠状病毒的N蛋白和S蛋白的免疫交叉反应既存在亚属内，也存在于不同亚属间，如SARS-CoV与hCoV-229E, hCoV-NL63也可能存在N蛋白和S蛋白的免疫交叉反应，因此，选择合适的编码抗原的序列用于抗原表达，是避免与其它冠状病毒发生交叉反应导致假阳性的前提条件。当然，如果是与SARS-CoV发生交叉反应，因是在SARS-CoV-2流行期间，没有SARS-CoV，有交叉对结果的判断也没有真正的影响。

关于阳性判断值，胶体金试纸条检测是通过肉眼观察颜色有否来判断阳性和阴性，没有阳性判断值，但会存在不同检测者判断的主观差异。化学发光免疫试验和酶联免疫吸附试验方法则需要设定阳性判断值，其较好的做法是通过测定大量的阴性人群（可数千份）和一定数量（可数百份）的已知阳性人群标本，会得到如图2的一个分布， 通过ROC曲线或其他统计学方法得到的阳性判断值，通常为假阳性和假阴性均较低且达到平衡状态时的测定信号如OD值或发光值。因此，不可避免处于其周边阳性一侧的结果，会有一部分弱阳性其实际为假阳性。


图2  依据阴性和阳性人群检测值的分布确定阳性判断值

干扰物质则有内源性与外源性之分。内源性干扰物质一般包括类风湿因子（RF）、嗜异性抗体、补体、因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体等。在日常的临床血清（浆）标本中，有相当比例的标本不同程度的含有上述各种干扰物质，从而可能导致测定结果的假阳性。例如在类风湿患者、其他疾病以及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的RF，其通常为IgM型，亦有IgG和IgA型，RF具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因此在免疫测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的标记的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。尤其是在捕获法IgM型特异抗体的测定中表现最为明显，因为此时固相包被的抗体为抗人µ链抗体，IgM型RF的存在可使其大量结合于固相。RF干扰通常可以通过稀释样本或加入一定浓度的尿素解离低亲合力结合的IgG和RF来避免或减少。嗜异性抗体（Heterophilic antibodies）引起的干扰可通过在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig，封闭可能存在的嗜异性抗体。但加入量不足或亚类不同时无效。此外，机体在抗病毒过程中，血液中的补体、溶菌酶等也可能增高，而其也可以将固相和标记抗体交联起来，最终也会导致假阳性结果，通过56℃30 min加热可使标本中的补体C1q灭活，可以避免由补体引起的干扰；Cu2+离子和卵白蛋白可有效地封闭溶菌酶，防止其联接IgG。非样本本身的外源性干扰则包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长和标本凝固不全等。采取避免标本采集过程中的溶血、避免血清（浆）分离过程中的细菌污染及贮存时间过长、标本凝固充分后再检测等措施应可有效地防止上述因素造成的假阳性结果。

如何有效发挥特异IgM和IgG抗体检测对新型冠状病毒感染的诊断和防控价值？
李金明教授：这个问题的确是一个需要面对的核心问题，前面提到特异的IgM/IgG检测容易受到一些干扰因素的影响而出现假阳性结果，那么最最重要的是如何去区别抗体阳性的“真”与“假”？打个比方，我们去国外，有时在街头看到一种行为艺术，就是有人将自已装扮成一个青铜雕塑，当然在街头也有本来的青铜雕塑，那么如何去区分这个青铜雕塑是真人装扮或还是真的雕塑呢？一个简单的方法就看这个雕塑随时间的推移，他会不会动。或者有人通过触摸，看其是否会动来区别。这里有一字，即“动”，“动”的是真人，“不动”的是假人。同样的道理可以用于特异IgM/IgG抗体的检测阳性的真假判断。当核酸检测为阴性时，IgM/IgG抗体检测出现图1中的四种模式的任何之一，不管后续的核酸检测是否阳性，只要是真正的病毒感染者，IgM/IgG抗体一定会出现一个此消彼长的变化，除患者的免疫功能因为疾病发展及治疗过程中出现严重受损外，应基本上都可以通过后续的抗体动态检测出现的结果模式明确诊断。此外，针对SARS-CoV-2刺突（S）蛋白的抗体具中和病毒的作用，采用S蛋白作为抗原的检测到的IgG抗体的出现并持续升高，应具有很好的预后及康复指示价值。

要注意的是，现在出现了将特异抗体的检测大规模用于复工或一般人群筛查的现象，如果这种筛查是用于确定患者是否感染病毒并据此是否需要隔离，则是不可以的；如果是用于疫区等高流行率人群的血清流行病学调查，则另当别论。其原因就是因为上述假阳性的出现是无法完全避免的。一般人群筛查，一旦出现阳性，会造成大量人群不需要的隔离，带来混乱。并且，抗体检测阴性，也不能排除病毒感染，因为感染早期抗体也不会产生，血液标本也有造成假阴性的干扰因素。所以这种筛查的成本效益极低。NMPA在已批准的2019-nCoV的特异抗体试剂盒说明书中的预期用途中都明确写出：仅用作对新型冠状病毒核酸检测阴性疑似病例的补充检测指标或疑似病例诊断中与核酸检测协同使用，不能作为新型冠状病毒感染的肺炎确诊和排除的依据，不适用于一般人群的筛查。

综上所述，特异IgM/IgG抗体完全可以作为COVID-19在病毒核酸检测阴性情况下的确诊标准，其前提是需要2次以上的动态检测以判断抗体阳性的“真”与“假”，以避免因标本中免疫测定干扰物质的存在所致的假阳性结果的误导。正因为有这种假阳性的存在，特异IgM/IgG抗体检测不适用复工等一般人群是否感染病毒的筛查，这是必须要强调的。

------------------------------------------------------------------------------

End

1500人QQ大群，欢迎加入

1号QQ群：140978441

2号QQ群：951835987

抗体世界：www.ivdab.com

IVD原料论坛：www.BBSivd.com

IVD原料世界--微信公众号