与qPCR相比，等温扩增技术极大缩短了扩增时间，可在恒定的温度下实现核酸快速高效特异性扩增，无需特殊仪器就可完成反应，灵敏度、特异性与PCR相近，近年来广泛应用于现场快速检测和大规模筛检需求。
目前在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增的应用最广，其结合CRISPR技术已用于新冠病毒检测。但环介导等温扩增需要4-6条引物，设计复杂，且易出现非特异性扩增。
本文介绍另外一种等温扩增技术，解旋酶依赖等温扩增技术（thermophilichelicase-dependent amplification，tHDA）。该技术不易产生非特异性扩增，同时也避免了PCR循环中升降温的过程，只需简单的设备即可检测。
①
tHDA是An等于2005年发明的一种等温核酸扩增技术，利用热稳定解旋酶代替qPCR中的热变性过程解开DNA双链，并在聚合酶的作用下延伸扩增。
主要过程如下图所示，包括：
利用DNA解旋酶（DNA helicase）解开DNA双链结构，同时将单链结合蛋白（single stranded DNA binding protein，SSB）结合至单链上，使单链保持稳定状态。
将经过筛选确定的最适引物结合至单链靶序列上，在DNA聚合酶的作用下合成新的双链DNA。
新合成的双链DNA作为模板，重复以上步骤，进入下一轮扩增，在65°条件下，tHDA能指数扩增核酸。
同时，tHDA与可以与多种逆转录酶兼容，实现对RNA病毒核酸的检测。
如上所述，由于DNA复制在单一的均匀温度(65°C) 下进行，只需一个简单的加热块，不再需要昂贵的实时热循环仪使用的一系列不同的时间和温度条件，设备要求简单。
通过对核酸扩增产物的检测，再结合实时荧光、凝胶电泳或者侧向层析等技术，可以对靶标进行定量或者定性的结果判断。
②
目前tHDA已经有不少成熟的商业化产品问世，其中有代表性的是Quidel公司的Amplivue和Solana系列产品。
其中基于tHDA方法开发的Amplivue将HAD技术与免疫层析方法结合，检测结果肉眼可判读，优点很明显，检测过程简单快速，无需专门的设备或复杂的软件即可实现结果报告。
其主要原理是采用生物素标记的引物与已被解旋酶分离的目标序列结合。然后采用荧光素标记的DNA 探针与单链生物素标记的扩增子结合。
将反应管加入卡式盒中，生物素标记的扩增子与标签垫上的链霉亲和素包被的红色乳胶珠结合，然后与涂有抗荧光素抗体的测试线结合。
基于tHDA方法开发的Solana系列产品则采用荧光方法对HAD产物进行检测。
其主要原理是先用特异性引物与已被解旋酶分开的目标序列结合。一端用淬灭剂标记、另一端用荧光团标记的特定DNA 探针与单链生物素标记扩增子结合。
与扩增子退火后，荧光探针被切割，由于荧光团与猝灭剂的物理分离，荧光信号增加，对结果进行荧光定量判读。
Solana 是一体化便携式的台式仪器，操作简单灵活，能够测试单个样本或一次最多批处理12 个测试，作为基于等温扩增技术的POCT分子产品值得借鉴。------------------------------------------------------------------------------
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发表于 2021-9-11 21:54:16
