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作者：刘勇 秦晓松 张智洁 刘建华 吴丽娜 卢丽萍 李婷 邵洋 单位：中国医科大学附属盛京医院检验科
2020年8月17日，国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组颁布了《新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范》，该规范中的10合1混采检测（10-in-1 test）技术，是指将采集自10人的10支拭子集合于一个采集管中的方法。该方法适用于低风险人群新冠病毒核酸的普遍筛查，不适用于“中、高风险及重点人群”新冠病毒的检测。该规范的制定有效满足了我国目前新型冠状病毒疫情常态化防控需求，大幅提升了对低风险人群[1]新冠病毒核酸检测的能力和效率，对指导各地做好新冠病毒核酸混采检测工作和应对秋冬季新冠肺炎疫情有重大意义。
一、样本采集耗材规格
该技术规范对采集管的材质及外观尺寸做了推荐，同时规定采集管容量企业定标10ml。病毒采集管内含带有颜色指示剂、病毒灭活剂的保存液6ml[2]，为单采管保存液3ml的2倍。保存液体积、成份及采集管尺寸的确定来源于前期基础实验研究结果及实践操作。
1. 保存液体积的倍增对弱阳性标本的检测结果无影响：本基础实验研究前期对新冠病毒核酸中值质控品（5000copies/ml）和临界阳性质控品（1000copies/ml）分别进行1:2、1:3及1:4倍稀释，以估计不同扩增试剂对新冠病毒阳性和弱阳性样本的检出能力，结果发现1:3以下稀释浓度的样本可以被准确检出。进一步详细评估了5种检出限在500-1000copies/ml的试剂盒的性能指标，其检出限均满足厂家使用说明书的标准。样本采集管中保存液由3ml增加到6ml（1:2稀释），其循环阈值（cycle threshold，Ct）增加1.0左右，符合理论推断，对于弱阳性样本的检出能力几乎没有影响。
2. 采血管尺寸、保存液体积及成份的设置便于实验操作：（1）采集管外径（14.8±0.2）mm，高度（100.5±0.4）mm，一方面采集管口径与拭子3cm的断点相匹配，拭子易于折断，且不会引起液体外溅，保证采集人员生物安全；另一方面该规格的采集管加入6 ml保存液及10支拭子后，拭子不拥挤，管中保存液具有较好的流动性，同时液面高度不超过管体高度的2/3，以上参数保证通过震荡的方式可将拭子上的上皮细胞充分洗脱，并有足够的液体用于检测，同时合适的液面高度也避免了对移液器的污染以及开盖时液体的迸溅。采集管盖子松紧适度，既不能打开困难，也不能过于松弛造成漏液。（2）保存液应当带有易于观察、辨识的颜色。此推荐主要是便于PCR操作时微量加样的准确辨识，推荐使用酚红作为指示剂。（3）保存液中应带有胍盐或其他有效病毒灭活剂。病毒灭活成份推荐使用合适浓度的异硫氰酸胍。该物质是强有力的蛋白质变性剂，能迅速将蛋白质与核酸分离，并且能够破坏RNA酶的分子结构，使样本中可能存在的核酸酶失活，起到稳定保存病毒核酸的作用。
3. 采集拭子宜选用聚酯、尼龙等非棉质、非藻酸钙材质的植绒拭子。植绒拭子是将尼龙纤维经专有的喷雾技术制成，与传统纤维缠绕的拭子相比，能吸附更多的生物样本并可达到较高的释放率[3，4]。棉质材料容易携带抑制微生物存活的物质，可能对病原体的检出存在影响。采集拭子折断点位于距拭子头顶端3cm左右，与采集管直径相匹配，利于折断；过长的拭子头会过多占用采集管内的空间。
二、采集地点要求
选择空旷、通风良好的场地作为大规模人群筛查集中采集地点，并划分为等候区、采集区、缓冲区和临时隔离区，利于有效分散待检人员密度。各区域根据天气条件配备保温、降温，遮阳、遮雨等设施并配备急救设备。各区根据功能配备标本采集、暂存、人员防护及户外消杀设备与用品。受检者按顺序从等候区进入采集区，人与人之间保持1米距离。临时隔离区用于暂时隔离在采集过程中发现的疑似患者或高危人群。
三、采集流程
1. 标识及信息登记：由于10合1混采检测技术要将10个受检者的标本放入同一个标本采集管中，系统详细记录被检者信息，并保证标本信息的可追溯性就显得尤为重要。所以规范中要求工作人员在采集前先将10个受检者编为一组，收集并登记受检者相关信息（姓名、性别、身份证号、联系电话、采集时间、地点等），并按照组别进行采集管编号。最好使用身份证读卡器、二维码条码等信息化手段关联受检者信息，保证信息读取效率和准确性。当无信息化条件时，可以提前登记纸质版《新冠病毒核酸10合1混采检测登记表》。纸质登记表随标本送检前需要备份存档于采集点所在社区，便于及时追溯受检者。
2. 采集方法：规范中描述了目前筛查最常使用的口咽拭子标本的采集方法。被采集人员头部微仰，嘴张大，发“啊”音，露出两侧咽扁桃体，采集人员将拭子越过被采集人员舌根，在两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后在咽后壁上下擦拭至少3次。操作完毕后，将拭子头置入管中、拭子折断点置于管口处，稍用力折断使拭子头落入采集管的液体中，弃去折断后的拭子杆，旋紧管盖，将采集管置于稳定的置物架上。为避免交叉感染，规范中特殊强调每例采集后采集人员均应进行手消毒。
3. 混合拭子：依照上述采集方法依次采集其余9支拭子，将完成采集的拭子放入同一采集管中，动作轻柔，避免气溶胶产生。连续采集10支拭子以后，旋紧管盖，防止溢洒。如采集管内拭子不足10支，应做好特殊标记并记录。
四、标本送检
首先需要核对采集管标签与混采登记表信息，确保准确完整，编号一致。标本按照A类感染性物质进行三层包装，符合《危险品航空安全运输技术细则》A类物品运输UN2814标准[5]。三层包装分别为透明塑料密封袋（一层容器），内配适量吸湿材料的包装盒或双层医用垃圾袋（二层容器），和具有“生物危害”标识的专用转运箱（三层容器），放入每层容器后需要密封，并用75%乙醇喷洒密封容器外部。其中二层容器和转运箱之间应当放置降温凝胶冰袋以维持低温保存环境，二层容器应当固定在转运箱中，保持标本直立，防止溢洒。
标准转运箱应由专门人员负责运送。标本应在采集后2-4小时内送至实验室。不能立即送检的，应配备专门冰箱或冷藏箱保存，并做好标本接收、保存登记。标本采集后24小时内可置于4℃保存。但是，近来国外有学者研究证实使用UTM、UTM-RT、ESwab、M4等多种病毒转运培养基和生理盐水保存标本，即使在室温储存一周仍然可以扩增出新型冠状病毒RNA[6]，短时间内运送标本是否需要冷藏条件还有待进一步研究。
五、实验室接收
运送和接收人员应当对标本进行双签收。标本接收时，除检查混采登记表是否填写完整，被检者信息是否可追溯，还需检查转运箱、二层容器有无破损。为保证操作人员安全，应当在生物安全二级实验室核心区打开转运箱，取出二层容器。在生物安全柜中打开二层容器和最内层密封袋，每层容器打开前，用75%乙醇喷洒或擦拭消毒，并检查是否密封完好。使用后的二层容器内外壁经75%乙醇擦拭消毒后移出生物安全柜，并在实验结束后使用紫外灯照射消毒。
取出采集管前需核对采集管标签与混采登记表信息是否一致，检查管壁是否有破损、管口渗漏等，如无破损、渗漏，用75%乙醇喷洒或擦拭消毒。如有破损、渗漏，应按标本泄漏污染处理，用吸水纸覆盖后使用0.55%含氯消毒剂进行消毒处理，做好不合格登记后销毁。
根据自身实验室的检测能力评估，标本如在24小时内可完成检测，置于4℃保存。否则标本应当置于-70℃或以下温度保存。如无-70℃保存条件，则于-20℃暂存。为提高阳性检出率，应避免标本反复冻融，设立专库或专柜保存标本，双人双锁管理。
六、标本检测与质量控制
1. 标本检测：由于混采标本为10个拭子放在同一采集管中，相对空间狭小，检测前必须进行充分震荡，保证所有拭子采集到的上皮细胞充分洗脱，之后再进行核酸提取及扩增实验。推荐选用包含针对新冠病毒开放读码框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核壳蛋白（nucleocapsidprotein，N）基因区域的试剂。依据我们前期实验结果，扩增试剂盒建议选择有国家药品监督管理局批准带有注册文号，检测限低、灵敏度高的检测试剂盒。
前期我们从参与研究的405名志愿者中，每人采集了2支咽拭子，1支置于含3ml保存液的常规病毒采集管（individual acquisition tube，IAT）中作为阴性对照，另一支放入10合1混采技术定制的含6ml保存液的病毒采集管（custom-made tube，CMT）中，9支来自不同志愿者的咽拭子为1个CMT。从45例SARS-CoV-2阳性患者中，每人采集2支咽拭子，1支放入IAT中，另1支放入含有9支阴性拭子的CMT中。所有IAT和CMT中的标本在收集后24小时内使用磁珠纯化法提取RNA。利用广州达安基因生物技术有限公司（中国广州，检出限500cp/ml）和武汉明德生物技术有限公司（中国武汉，检出限500cp/ml）的试剂盒，分别对SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因片段进行RT-PCR扩增。扩增仪器使用试剂盒推荐的Roche LightCycler 480（Roche，IN，USA），按照试剂盒说明书的建议设置扩增条件为：50℃ 15min，95℃15min，45个循环的94℃ 3s，55℃ 45s（达安）；50℃ 15min，95℃ 3min，40个循环的95℃ 3s，60℃40s（明德）。记录Ct值，并根据厂家说明书要求对结果进行评估。结果表明采用CMT和IAT采集的阳性样本，其检测结果高度一致。
2. 检测质控及质控结果：为保证核酸提取和实验室扩增过程质量，每批检测均需要将质控品随机放在临床标本中，参与从提取到扩增的全过程。其中至少需包括1份弱阳性质控品，可监测实验室能否检出低病毒载量标本；2份阴性质控品（试剂盒自带阴性质控品）和1份空白对照品（生理盐水或焦碳酸二乙酯处理水），空白对照品应当开盖放置在提取仪或操作台面上过夜，以便及时发现实验室是否存在标本间的交叉污染及环境污染。弱阳性质控品测定为阳性，阴性质控品全部测定为阴性，视为在控。如失控，不可出具检测报告，应立即分析查找原因，必要时重新检测标本。
七、检验结果处理
目前国家药品监督管理局已经批准的新冠核酸检测产品大多数为荧光PCR法，其他还包括恒温扩增芯片法、联合探针锚定聚合测序法等，因此新冠病毒核酸定性检测报告应当包括检测结果（检出/阳性、未检出/阴性）、方法学和检出限等。依据所用扩增试剂说明书，判断检测结果为未检出/阴性或者检出/阳性。为避免漏诊，若结果处于灰区，建议作为混采阳性结果进行复核。当混采检测结果为阳性、灰区或单个靶标阳性时，应通知相关部门对该混采管的10个受试者暂时单独隔离，并重新采集单管拭子进行复核。复核单管核酸检测如均为阴性，则按照阴性结果回报。暂时隔离人员即解除隔离；如检测结果为阳性，按程序上报。
八、检测后标本处理
检测后的标本应当尽快就地销毁，按要求做好高压灭菌质量监控和消毒、销毁记录[7]。
九、技术人员基本要求
采集人员和检测人员应满足《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行）》要求。即采集人员需经过生物安全培训且培训合格，熟悉标本种类和采集方法，熟练掌握标本采集操作流程及注意事项，同时做好标本信息的记录，确保标本质量符合要求，标本及相关信息可追溯。实验室检测技术人员应当具备相关专业的大专以上学历或具有中级及以上专业技术职务任职资格，并有2年以上的实验室工作经历和基因检验相关培训合格证书。工作人员数量应当与所开展检测项目及标本量相适宜，以保证标本及时进入检测流程、及时汇报结果[8]。
十、生物安全防护
对于采集低风险区域人群的采集者，可采用二级生物安全防护：一次性帽子、医用防护口罩（N95）、手套（必要时双层）、护目镜/面屏、隔离衣，鞋套（必要时）。由于标本箱在运输前已做消毒工作，因此标本运送人员采用一级生物安全防护即可，穿工作服，戴医用外科口罩和乳胶手套，可戴医用防护帽。
依据新型冠状病毒的传染途径，标本接收人员及实验室检验人员，除处理标本的人员必须严格遵照三级防护标准，其余人员可采用二级生物安全防护。生物安全三级防护包括医用防护口罩或N95、单或双层乳胶手套、面屏、护目镜、工作服外防护服、单或双层医用防护帽，手卫生。必要时双层口罩（外医用防护口罩，内N95）。值得注意的是没有必要超出此防护标准，过度防护不但会造成浪费，还有增加感染的风险。
十一、相关定义
1.“中、高风险人群”：疫情发生时，居住或停留于当地政府划分的“中风险地区”和“高风险地区”人群。
2.“重点人群”：为密切接触者、境外入境人员、发热门诊患者、新住院患者及陪护人员、医疗机构工作人员、口岸检疫和边防检查人员、监所工作人员、社会福利养老机构工作人员[9]。
综上所述，《新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范》对新冠病毒核酸10合1混采检测技术中的标本采集耗材规格、采集地点、采集方法、实验室检测、人员和生物安全防护等方面做出了具体详细的指导。该技术能够显著节省低风险人群大规模新冠病毒核酸筛查的成本，在保证检测结果准确的前提下，明显提升新冠病毒核酸的检测效率。在现有核酸检测能力和条件下，为快速诊断新冠病毒感染和控制疫情传播提供了理想策略。
注：本文来源于《临床实验室》杂志2020年第10期“感染性疾病”专题
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发表于 2020-11-13 21:51:06
