来源：中国医疗器械信息 2023,29(19),33-35、全国体外诊断网 CAIVD
摘要
从体外诊断试剂注册技术审评角度出发，概述液质色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测25-羟基维生素D在临床上的应用价值，对此类产品的审评要点展开讨论，重点讨论性能研究、临床评价研究等，以期为注册申请人对该类产品在研发和注册过程提供技术指导和参考依据。
维生素D又称25-羟基维生素D(25(OH)D），为脂溶性维生素，已有研究表明其具有多重生物学作用。维生素D在人体内主要以两种分子形式存在，分别为维生素D2(25(OH)D2）和维生素D3(25(OH)D3），通常人体维生素D(25(OH)D）的含量即代表25(OH)D2和25(OH)D3含量的总和[1]。25(OH)D不仅在保证人体内钙离子和磷离子的动态平衡方面起着关键作用，能和钙离子一起促进儿童骨骼的形成和维持成人骨骼强度，它的缺乏将会致使儿童佝偻病及成人软骨病的发生[2]。此外，血清25(OH)D的浓度还与肌肉力量、大小以及非特异肌肉酸痛有关[3]。因此，半衰期长、性质稳定的25(OH)D被认为是评价体内维生素D水平的重要指标，开展高质量的25(OH)D检测具有非常重要的临床意义[4]。本文重点关注25(OH)D液质色谱-串联质谱法（Liquid ChromatographyMassspectrometry/Mass Spectrometry,LC-MS/MS）在临床的应用，并且与作者在医疗器械及体外诊断试剂产品注册技术审评工作中的实际体会相结合，对25(OH)D产品的临床性能评价给出一些建议。
25(OH)D检测方法及应用范围
目前临床上普遍应用的25(OH)D检测方法包括：化学发光法、免疫分析法以及LC-MS/MS等多种方法[5]。不同的诊断方法有各自的优势和局限性。已有研究表明，LC-MS/MS方法学与传统的生化免疫方法学相比，前者用于小分子待测物的定量检测更加准确，如激素类、维生素类、各类药物及其代谢物等小分子物质[6]。该方法学在低浓度被测物检测和多组分联合检测中具有显著的优势。根据2022年欧洲微量营养素指南，总25(OH)D的血清/血浆浓度，即25(OH)D3和25(OH)D2的总和，被认为是维生素D状态的有效生物标志物；LC-MS/MS是检测的金标准方法，因此，《临床儿科杂志》已明确指出，在儿童维生素D有关的定量测定研究中，建议使用欧洲微量营养素指南中推荐的黄金标准来定量测定25(OH)D，即LC-MS/MS法[7]。
在临床当中，维生素D具有多种生物学作用，如可促进小肠钙吸收[8]；促进肾小管对钙、磷的重吸收[9]；调节血钙平衡；其代谢物参与多种骨代谢途径等[10]。因此，25(OH)D的检测对于多类人群的健康评估与临床诊断有良好的参考价值。研究表明，妊娠期并发症及妊娠结局与孕妇血清25(OH)D水平具有良好的相关性[11]；血清25(OH)D可用于诊断绝经后骨质疏松，为临床预防、干预治疗提供一定的依据[12]。此外，开展25(OH)D检测对产后出血预测、维生素D缺乏性佝偻病、慢性气道疾病、老年慢性阻塞性肺疾病、妊娠糖尿病预测等多种疾病的辅助诊断或预测具有关键作用。因此，及时了解人体内25(OH)D含量的状况并实现对25(OH)D的个体化及时补充具有十分重要的意义。
综上可知，在现有的认知下，LC-MS/MS法检测试剂在25(OH)D检测中的优点和大量的临床应用已得到广泛认可。在临床应用中，应根据条件选择更优的检测方法并规范应用，对于有条件的检测机构，尽可能采取准确性高的检测方法，提高检测结果和临床诊断的准确性[13]。
分析性能研究
LC-MS/MS方法测定25(OH)D试剂的注册申请人应确保原材料和工艺技术已在确认的条件下进行验证及测试，并且在质量管理系统有效运行以及确保产品质量符合要求的前提下，进一步对拟申报产品进行其性能分析及评估[14]。对于分析及评估性能的样本，应保持其与实际临床中使用的样本一致，一般来说，产品质控品和参考品不能作为性能评估的样本[15]。
2.1 校准品及质控品性能评估（如适用） 校准品是体外诊断试剂产品成分的重要部分，一般情况下它的用途是在试剂进行检测时对检测物质进行校准。在申请人申报资料内，阐述校准品溯源性的技术文件应详细描述校准品溯源链的详细信息以及该校准品溯源链顶端所用的参考测量程序，同时也应包括溯源链顶端传递至下一级时所符合的标准、计算方法以及不确定度的影响因素等[15]。针对25(OH)D检测试剂的校准品和质控品，申请人应当对其性能进行合理的评价，评价内容应至少应当包含外观、准确度和均一性。
2.2 准确度 体外诊断试剂产品的准确度性能代表的是该检测试剂针对待测物质的检测结果与待测物质的真实值之间的接近程度，LC-MS/MS方法检测25(OH)D试剂的准确度评价方法主要有以下几种：回收试验、参考物质检测、比对试验等。在上述方法中，建议申请人优先使用参考物质检测方法。通常用相对偏差来评估准确度性能，针对25(OH)D国家已经发布了相应的标准品，注册申请人在研究和评价该试剂的准确度性能时，可以考虑使用国家标准品[16]。在使用国家标准品进行性能评价时，应当着重考量对检测结果的偏差值。申报试剂对25(OH)D国家标准品的实测值与相应国家标准品实际值相对偏差≤±15%。
2.3 精密度 体外诊断试剂的精密度性能反映的是检测试剂多次测定某物质的不同结果之间的相近程度，精密度评价结果通常受到随机测量误差大小的影响。重复性、中间精密度和再现性是精密度性能的三个重要组成部分。重复性一般反映同一测试人员在同一测试背景下（如实验环境、测试仪器、测量系统、产品批次等）对同一产品进行检测所获得的结果，此结果也称为室内精密度。中间精密度通常反映测试人员在同一测试实验室不同条件下（如实验时间、操作员、仪器、设备参数等）获得的测量结果。而再现性通常表示在不同的测试地点、不同实验者及不同条件下针对目标物质检测结果的精密度，该性能通常代表室间精密度。申请人对25(OH)D试剂进行精密度研究时，应将试验者、检测仪器、试剂的生产批次、校准信息（校准品的批次，校准的周期）、试验地点、试验时间、试验环境和条件等因素贯穿精密度研究的整个过程中[16]。
2.4 检测限 体外诊断试剂产品的检测限指标通常包含空白限、检出限以及定量限等，而对于25(OH)D而言，其在正常人群样本中的测量值区间约为30～60ng/mL。因此，最低检测限值过小可能没有实际临床意义。因此，针对25(OH)D检测试剂，申请人应当至少对定量限性能进行建立及验证。定量限性能应充分考虑可能出现的异常值和精密度要求，并确保定量限的检测值符合预设的准确度指标。
2.5 线性范围 对于LC-MS/MS法25(OH)D检测试剂产品而言，产品的线性范围的下限应大于零，产品申请人可使用不同浓度的临床样本，配制一系列具有浓度梯度的临床样本，以研究和验证样本的线性范围，在检验方法中，应当明确配制不同浓度临床样本的个数，浓度应覆盖线性范围的最高值和最低值。在进行线性范围的验证时，可以选择5～7个浓度水平样本进行验证[16]。此时选用的5～7个浓度水平应能够覆盖全部预期的检测范围，并且能够包括与临床意义直接相关的重要评价浓度，如试剂的最小测定浓度或线性范围的最低限、试剂的最大测定浓度或线性范围的高限等。申请人应采用申报的25(OH)D检测试剂对每个浓度的临床样本最低重复测试3次，并且计算检测结果的平均值，将检测结果的平均值和稀释比例用最小二乘法进行线性拟合，并计算相关系数r。一般而言，25(OH)D检测试剂的线性范围应当覆盖[8.1,70.0]ng/mL，且在申请人声称的区间内，r应≥0.99。保证产品能满足临床检测的需要。
临床评价研究
临床评价和临床试验是体外诊断试剂的主要评估途径，25(OH)D检测试剂的反应原理和预期用途明确，生产工艺及流程已经完善，并且产品已列入《免于临床试验的体外诊断试剂目录》[6]。因此，申请人可以将25(OH)D检测试剂和同类产品的方法学进行比较，来验证25(OH)D检测试剂的安全性和有效性。截止2023年6月，我国境内已有大量生产企业获得了包括LC-MS/MS方法学在内各类25(OH)D检测试剂注册证书，申请人可依据自身产品特点选择合适的境内已上市同品种产品进行比对试验。如申请人对申报产品临床评价资料有特定要求或申报的25(OH)D检测试剂有特殊的临床用途，申请人也可以采用在两家或两家以上临床试验机构开展临床试验的方式进行25(OH)D检测试剂的临床评价，临床试验应当符合《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》，临床试验的过程需要遵守《医疗器械临床试验质量管理规范》的要求。临床评价过程中应注意以下几点。
3.1 比对方法的选择 由于25(OH)D检测项目广泛应用于临床各个领域，有大量境内及进口产品已在国内上市，并且包含各类方法学的检测试剂一应俱全。因此对申请人来说，最经济、最合理的研究方法是在方法学比较试验中使用已上市的同类产品。在选择同类产品时，申请人应尽可能选择方法学与性能近似待检测试剂的产品作为比对试剂。如申请人认为自身所申报的25(OH)D检测试剂产品优于同方法学的已获证试剂，也可以采用准确性、线性范围等性能指标相近的其他方法学的检测试剂作为比对试剂，由于LC-MS/MS方法是小分子物质检测的金标准，对于LC-MS/MS法25(OH)D检测试剂而言，应尽可能优先与LC-MS/MS方法学已上市试剂进行比对。
3.2 研究样本的选择 申请人在临床评价试验中使用的样本应包括以下信息：样本来源、样本类型、样本储存状态、可追溯编号、临床诊断信息（样本浓度超出参考范围的患者）等，样本总数也应符合统计和法规要求。在所有被使用的临床样本中，应含有合理数量包含干扰物的样本，同时所有被使用的临床样本的25(OH)D浓度应能够覆盖具有临床意义的25(OH)D浓度范围。在进行临床样本选择时，应当充分考虑到年龄、性别的差异，所使用的临床样本尽可能覆盖产品预期适用的各类人群。
3.3 检测数据的统计分析 在临床评价实验后，申请人应对实验过程的检测数据进行收集和分析，首先应绘制散点图和差异图，可直观地体现检测数据是否覆盖了具有临床意义的25(OH)D浓度范围、检测数据在25(OH)D浓度范围内的分布情况以及是否存在离群值等，一般情况下，离群值的个数不应超过2.5%。同时，申请人应明确回归分析方法和对申报试剂和比对试剂偏倚的评价。偏倚的评价一般将医学决定水平处的预期偏倚及其95%可信区间与申报产品的可接受偏倚的限值进行比较。
小结
在前人的研究中，已证明25(OH)D具有多重生物学作用，因此，对该项目开展准确的临床检测，亦具有重要的意义。检测25(OH)D方法有多种，其中LC-MS/MS方法学检测试剂产品因其方法的优点而具有较高的临床应用价值。相关产品的注册申请人可通过严格筛选原材料，优化产品的生产工艺，保证25(OH)D检测试剂产品具备良好的性能，成为临床中多种相关疾病有效的辅助诊断和疗效评价的工具。作者根据现行的体外诊断试剂相关法规和注册申报的相关信息要求，总结分析了LC-MS/MS测定25(OH)D检测试剂的注册申报过程中相关技术文件的技术审评方向。并且对分析性能研究及临床研究等方面作了概述，希望本文可为LC-MS/MS法测定25(OH)D检测试剂的注册申请人在研发、注册过程中提供技术指导，同时为药品监督管理部门审评人员提供参考依据。
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发表于 2023-11-18 15:29:25