深度揭秘：胶体金试纸条核心技术

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1 物料选择及处理

一、底片材

主要是承载和黏合其它物料，个别试纸条没有底片材。底片材要求不高，只要别粘性不好导致玻纤脱落或者太薄加烘后变形就好。

对于无背衬的NC膜，做加速稳定的实验，底片材的胶有可能会渗入NC膜，导致C/T线出现一条很明显的黑线，解决方法：更换有背衬的NC膜或更换原料点膜缓冲液。

二、NC膜

NC膜是整个胶体金试纸条免疫反应的载体，目前市场基本上被德国Sartorius、美国Millipore 和印度MDI三家占领，其中Sartorius应该是最常用的，主要包括CN180、CN150、CN140、CN140Unbacked、CN110、CN95六种型号，数字越大膜孔径越小，流速越慢，Millipore有HF180、HF135、HF120和MdI有15u、10u，具体参数大家可参阅相关COA。Millipore性能综合不错，但是价格相对贵一些，供应不太稳定，可选择用于一些流感、心肌等利润较高的产品；Sartorius的CN140较为常用，项目前期可直接先用它来初筛原料，MdI 15u的背景很干净，可用于一些传染病或者早孕产品。国内的深圳百穗康公司生产的NC膜很不错，可以替代进口的。

原料在包被到NC膜上之前需要稀释到合适的浓度，包被的稀释液：PB或者PBS缓冲液最为常用，为解决某些问题还会添加一些化学原料，如添加海藻糖和蔗糖是为了保持良好的稳定性、TWEEN 20和EDTA是为了减轻部分反白现象、BSA和Casein作为封闭剂对膜进行封闭。

三、样品垫

样品垫能分离过滤样品中的杂质，对样品进行前处理，平衡待测试样品的PH和调整盐离子强度，使样品在层析过程中保持一定的均一性和可控性。样品垫的材料主要选择玻纤、无纺布和滤纸，其中以Ahlstrom的8964玻纤较为常用。

样品垫需要经过前期处理才能使用，处理液一般包含缓冲液、表面活性剂和其它生物原料。根据产品使用的样本类型选择合适的缓冲液，缓冲液主要包括Tris、硼砂和磷酸盐缓冲液，尿液样本硼砂缓冲液用的多一些，血液样本Tris和磷酸盐缓冲液用的多一些。


表面活性剂用的较多的包括TWEEN 20、TRITON X-100、Tetronic 1307等，建议优先选择非离子表面活性剂。其它生物原料的加入是为了解决跑板过程中出现的异常，如加入聚乙烯吡咯烷酮增加亲水性，BSA、异嗜性抗体和酪蛋白可以特异性吸附杂蛋白，降低可能出现的假阳性，EDTA可以减少轨线和消除部分反白作用等。处理液还需要加入防腐剂叠氮钠或Proclin-300，最后调节一个最合适的PH然后处理在玻纤上，烘干即可。

四、标记垫

标记垫是胶体金颗粒附着的载体，有些试纸条没有标记垫，将标记物直接点在样品垫上或者NC膜上也能满足要求。具备非特异性吸附力低、标记物复溶和释放力好的材料可用于标记垫，目前市场上标记垫主要用的材料是聚酯膜、玻纤和无纺布，其中芬兰Ahlstrom的6613聚酯膜较为常用，项目前期可直接先用它来初筛原料。与样品垫一样，标记垫在喷点金标之前一般也需要进行前处理，处理液与上述相似，可根据具体项目配置合适的处理液。

五、吸收垫

吸收垫基本上都是选用滤纸，选择要求不高，有良好的亲水性和保水性即可。

2 原料标记

一、原料选择

抗原抗体原料是胶体金试纸条反应的核心。目前市场性能好的原料大部分还是以进口为主，芬兰的Medix和HyTest、美国的Merdian、Biospacific和Abnova等，国内春雷杰创公司也不错。

金水制备

胶体金是氯金酸与还原剂（如柠檬酸钠）反应形成带负电的疏水胶体溶液，反应过程颜色变化是浅黄色-透明-黑紫色-紫红色，控制氯金酸与还原剂的比例可以得到不同粒径的胶体金溶液，通过肉眼观察溶液颜色可粗略估计颗粒的大小。标记抗体原料用40nm的较多，抗原和小分子蛋白选用20nm较多，大颗粒灵敏度会相对好一些，但特异性就很难保证了。

金颗粒标记

标记：蛋白质结合到胶体金上的过程。标记过程使用的器皿一定要保证干净。

标记主要过程：
1. 合适的PH体系，胶体金颗粒与蛋白原料结合；
2. 加入封闭剂对胶体金表面未与特异性蛋白结合的位点进行封闭；
3. 高速离心浓缩胶体金溶液，最终的溶液OD值控制在130上下；
4.去上清，加入适量保存液保持即可。

标记前要确定最佳的PH体系，一般选择在略高于蛋白质PI，PH不合适很容易导致死金。蛋白原料的加入需要提前稀释，否则高浓度原料直接加入胶体金溶液也容易死金，也可以将胶体金溶液加入到原料中。某些重组抗原难标记，可以使用抗体搭桥标记，先标记一个重组抗原的标签抗体，然后再与重组抗原结合。

乳胶标记

乳胶颗粒的供应商主要有Agilent、Merck、Bangs、Thermo和旭化成，综合评估旭化成的颗粒应该是不错的，但也是最贵的。乳胶颗粒包括物理吸附和化学偶联颗粒，化学偶联颗粒用的较多，偶联过程分使用EDC活化的一步法和EDC+NHS活化的两步法。

3 试剂条结构

常见试剂条结构：样品垫+标记垫+NC膜+吸收垫，后来开发出新的结构：无标记垫结构、双标记垫结构、桥垫结构和金标垫反粘结构等。

无标记垫结构

将标记物处理在NC膜上或者样品垫上就可以省去标记垫。处理在NC膜上胶体金可能比较少，乳胶会多一些，使用这种结构灵敏度会弱一些，标记物释放没有那么完全，对灵敏度要求不是特别高的或者灵敏度已经满足要求的可以尝试一下。

双标记垫结构

常见于多对原料产品，比如HIV和Flu A&B，HIV包括Ⅰ型Ⅱ型和O型，因涉及到多种亚型，用的原料比较多，全部处理在同一标记垫上可能相互会产品影响，可以选择双标记垫结构。有些产品因标记物释放的影响，双标记垫结构一般比用相同使用量的单标记垫灵敏度会高一些。不过这种结构会对后期生产增加难度，处理不当标记垫容易脱落。

桥垫结构

桥垫结构是在样品垫与标记垫之间加一段连接垫，桥垫也需要使用处理液进行处理，对于样品垫投放了反应原料的产品，桥垫可以使样本与样品垫上的原料反应更加充分，提升产品性能，对于样品垫未投放反应原料的产品，桥垫可以减缓样本流速，有助提高产品灵敏度。桥垫的材料与样品垫一样，主要是滤纸、玻纤和无纺布，或者可以尝试一下聚酯膜。

金标垫反粘结构

金标垫反粘是将喷金的那一面朝下粘在底片材上，比较少见，目的是为了降低金标的释放速度，提高个别产品性能。

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