从生物原料药（ActivePharmaceutical Ingredient，API）中去除蛋白质聚体至关重要，因为它们有可能增加免疫原性。虽然大多数聚体是在上游工艺期间形成的，并且随着滴度的增加，在分子水平上形成聚体的风险也增加了，但如果下游操作选择了不合适的条件，则在下游加工过程中也会发生聚集。
聚合机制
在蛋白质聚集的机制上，基本上有两种机制导致聚合。一种情况是，蛋白质从其天然状态到变性状态的解折叠可能导致先前内部疏水结构的暴露，这些结构可以与其他分子上的类似疏水表面结合并形成聚体。或者，天然蛋白质可以通过其外表面区域上的疏水区域的相互作用形成聚体。
此外，蛋白质聚集可以指广泛的分子行为，从二聚体形成到由于疏水性介导的非共价相互作用和通过链间未配对硫醇基团配对的共价相互作用引起的可见颗粒等。 聚体的形成通常取决于溶液条件（电导率和pH值）、蛋白质浓度和温度。此外，聚体相对较小时可溶，较大时不溶，聚集可能是可逆的（来自小聚集体）或不可逆的（尤其是基于变性蛋白质时）。还有就是，不完全折叠和未折叠产物的数量以及未配对的半胱氨酸残基的存在也会影响聚体的形成。
重要的是，可能导致聚集的条件可能发生在纯化过程中，需要避免或减轻。特别是，不溶性聚体的再溶解通常需要额外的工艺步骤，而且成本非常高，也会影响整体工艺产量。
蛋白表面化学条件的改变
利用治疗分子和杂质（包括聚体）的亲和力、电荷、大小、疏水性和其他理化特性的差异，在几个步骤中实现回收和纯化的下游加工。每个操作步骤的不同组合可用于回收和纯化给定的产品，包括离心、各种类型的层析（例如亲和、离子交换、疏水等）、过滤、重折叠和沉淀的工艺开发。
包括色谱层析、病毒灭活、病毒过滤和其他过滤模式在内的所有操作步骤都可能制造导致蛋白质聚集的条件，包括pH值和电导率的变化、高蛋白质浓度和剪切力。 在下游加工过程中尽量减少聚集形成的策略主要包括选择溶液条件和纯化用固定相（用于色谱），以防止聚集并在纯化所需的条件下稳定蛋白质，有时通过添加赋形剂或其他添加剂。后者的最新例子包括添加抗氧化剂，如抗坏血酸和谷胱甘肽，以防止通过活性氧氧化蛋白质产生聚集位点，例如赖氨酸基团上形成醛，然后可以反应形成共价席夫基聚体。
离心和过滤
离心可能会使蛋白质在进入离心转子的进料区位置受到强烈的剪切力。
剪切力可以通过细胞裂解直接或间接导致蛋白质聚集，这一步骤也会导致酶促反应催化的聚集。在离心和过滤过程中，蛋白质在气液界面处的暴露也会导致可溶性或不溶性聚体的增加。然而，技术进步正在发挥作用。离心机的气密密封现在最大限度地减少了气液界面，并且可以使用具有最小化气流所需转速的真空泵。也已确定在离心中合适的溶液条件也可以使剪切力最小化。
色谱层析
色谱通常是大多数纯化过程的主要手段。但是，这一步骤也提供了发生聚合的机会。
蛋白A 层析通常用作捕获步骤，用于从细胞培养物中去除大量杂质。该步骤需要在低pH值下洗脱，然后通常的步骤为进行低pH值灭活潜在的外来病毒。在这两个操作步骤中，蛋白质都暴露在低pH值环境中；在这种条件下，有些蛋白可能不稳定，从而导致聚集。 另一方面，离子交换色谱利用电荷和偶极矩的差异将产物与杂质分离。特别是，通常使用结合和洗脱或流穿操作模式将蛋白质聚体与纯化产物分离。然而，如果不加以控制，这些操作也可能导致聚体的增加，这通常是由于蛋白质在介质的固定相上吸附时蛋白质解折叠。 疏水相互作用色谱通常用作去除基于疏水性的杂质的精纯步骤。
树脂和产品之间的强疏水相互作用可能会导致聚体形成，这也能够诱导改变产品表面的结构而产生聚集。 为了避免在色谱纯化过程中可能导致聚集的相互作用，重要的是选择合适的固定相（介质），其配体和骨架结构可以最大限度地减少二次相互作用，并为洗脱和灭活选择合适的温度和pH值。如果聚集在这个过程中自发发生，它就可以说明这种介质不是用于纯化的合适属性，而是被纯化蛋白质的属性（即它对所需条件的敏感性）。选择其他条件或使用不同的纯化方法通常有助于避免这个问题。 亲和技术的进步也有助于解决一些聚合问题。例如，某些亲和配体/层析树脂设计用于在酸性较低、pH值较中性的条件下进行洗脱。 重折叠和过程中保持操作基于大肠杆菌的发酵过程可能导致产物以包涵体形式被困在细菌细胞壁内。
在这种情况下，采用重折叠将回收的包涵体转化为活性产物。由于是在体外反应，重折叠可能导致聚集物质的形成。 最后，在蛋白质的下游加工过程中，由于操作步骤执行的不连续性，产品可能需要在完成上一步后保存。这种保存操作一直保持到下一个操作步骤准备好为止。在某些情况下，产品可能处于会引起结构变化的环境中，从而导致形成聚体或其他不受欢迎的产品相关物种。不过，可用于连续加工的新方法可能会减少蛋白质在这种不利环境中必须花费的时间。
PAT的优势
过程分析技术(PAT)的进步为更有效地控制生物加工中的蛋白质聚集提供了机会，动态光散射是一种非扰动技术，例如，已被用于监测基于重组蛋白候选疫苗生产的包涵体溶解、蛋白质重折叠和聚集。然而，在完成适当的成本/收益分析后，需要证明使用这种实时过程分析技术来监控和控制产品聚合是合理的。
如何避免纯化中所带来的聚集
最近，通过仔细选择和工艺设计能抵抗聚集的活性生物制剂或导致生产过程中聚集倾向降低的蛋白质表达细胞系，已经做出了巨大努力来防止聚集。作为开发早期单克隆选择的一部分，许多公司正在研究具有良好生产力的单克隆细胞的特征，以了解该克隆具有哪些与纯化相关的特征。在该阶段可以取消选择产生高聚合水平或不稳定且有自关联倾向的克隆。这种方法比在下游操作中解决问题更强大、更有效。
从细胞表达源头控制的技术将成为一种更好的方法来控制表达并最大限度地减少聚体形成和其他与产品相关的杂质问题。不过，现在还为时过早，但我们期待在可预见的未来找到良好的细胞系和表达系统构建解决方案，这也将有助于纯化过程。 目前，在候选选择阶段使用高通量筛选技术来选择不太容易聚集的构建体（蛋白质），以及可以进一步帮助减少聚集的细胞系和细胞培养条件。
生物信息学也被用于应对减少聚集的挑战。为了避免聚集，先进的生物信息学在分子设计中的应用越来越多。目标是改进活性生物制剂的表面设计，以通过增加带电氨基酸的数量和消除未配对的半胱氨酸来降低疏水性和增加亲水性。 还正在探索使用高压来分解和重新折叠蛋白质以控制以及逆转聚集。该技术由科罗拉多大学开发。现在说这项技术可能带来哪些好处或挑战还为时过早。然而，总的来说，尽可能避免聚集似乎是最好的途径。
文章来源： 1. Z. Yu et al., J. Pharm. Sci. 102(12), 4284-4290 (2013). ------------------------------------------------------------------------------
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发表于 2021-10-2 21:46:06
