癌症患者的血浆游离DNA基因组特征

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包括癌症基因组图谱（TCGA）和MSK-IMPACT临床测序队列（MSKCC）在内的多个国际联盟已经对多种肿瘤类型进行了全面的基因组分析。这些努力极大地增强了我们对癌症基因组的理解，并为世界范围内的癌症研究提供了开放获取的资源。然而，根据2018年全球癌症统计数据，这些联盟主要关注白种人群患者的情况，缺乏来自亚洲患者的数据，而亚洲患者分别占总癌症发病率和死亡率的50%和70%。尽管中国是世界上人口最多的国家，但中国患者仍然缺乏全面的基因组资源。因此，明确中国患者的泛癌基因图谱有助于改善治疗方案和生存率。

基于血浆游离DNA（cfDNA）分析为肿瘤基因组提供了另一条途径，克服了肿瘤内异质性的问题。肿瘤来源的cfDNA可在多种癌症类型中检测到。然而，与基于组织的基因组图谱相比，从cfDNA中获得的基因组信息所获得的广泛见解带来了额外的复杂性。循环肿瘤DNA (ctDNA) 和组织测序之间的一致性和差异已在一定程度上得到评估，但可能会被时间和空间的异质性所混淆。此外，ctDNA的可检测性受到肿瘤大小和技术平台的限制。考虑到这些因素，ctDNA和组织测序在提供有关癌症基因组的关键信息方面是相辅相成的。

尽管近年来发表了许多与ctDNA相关的研究，但对不同癌症类型的ctDNA的大规模分析仍然缺乏。为了填补这一空白并了解中国特有的癌症基因组，来自北京大学肿瘤医院和中国人民解放军总医院的研究团队，基于华大基因MGISeq-2000测序平台，采用了一种靶向深度测序方法，最佳地研究血浆cfDNA中肿瘤来源的基因组改变，即使是低等位基因部分(AFs)。为了消除克隆性造血 (CH) 相关变异的干扰，研究人员还对白细胞 (WBC) DNA进行了平行测序，并与cfDNA进行比较，以识别肿瘤特异性基因组改变。此外，研究人员使用ctDNA来量化肿瘤内异质性和克隆性，并探讨泛癌患者靶向治疗的敏感标志物的前景。本研究的结果为进一步探索和应用CTDNA提供了基础，并确定了需要额外的战略和技术改进的局限性。最新研究结果已于近日以Pan-cancer circulating tumor DNA detection in over 10,000 Chinese patients为题发表在了Nature Communications上。




研究人员分析了11525名患者的13333份血液样本。从血浆和匹配的白细胞中分离的DNA进行杂交捕获和靶向深度测序，以检测体细胞单核苷酸变异（SNV）、小片段插入和缺失（INDEL）、拷贝数变异和染色体重排。研究队列包括41种主要的肿瘤类型。超过一半的样本来自转移期患者（临床IV期， 54.8%），11.4%来自局部或区域分期（I-III期），33.8%缺乏详细的分期信息。所有血浆样本均测序至深度覆盖（中位数4429×；范围1000–30368×），以确保检测基因组改变的高灵敏度。白细胞的中位数测序深度为423×（范围369-7279×）。

研究人员通过cfDNA追踪WBC中的CH变异，发现1861年血浆样本中有2754个突变(14.0%)。与CH相关的15个典型基因包括DNMT3A，TP53，TET2和PPM1D等最常出现的基因。在超过20％的黑色素瘤，膀胱癌，子宫癌和前列腺癌的血浆样本中以及在<10％的肾癌和甲状腺癌的样本中检测到CH变异。可检测到的癌基因类型各不相同。CH变异倾向于随着年龄的增长而出现，CH变异在9.1%的年龄小于40岁的患者和23.1%的年龄大于80岁的患者中出现。

在消除CH变异体后，研究人员在9801份血浆样本中检测到51133个非同义突变、1945个拷贝数变异和442个重排。ctDNA检测的总灵敏度为73.5%。ctDNA的检测能力在不同的癌症类型中有所不同，SCLC为91.1%，前列腺癌为87.9%，子宫癌为77.6%，HCC为77.1%和UGI癌为76.9%，显示与其他癌症类型相比具有更高的敏感性。甲状腺癌为41.8%，肾癌为56.4%，其ctDNA检出率较低。大多数IV期样本 (79.7%) 有可检测到的改变，而较小比例的I-III期样本 (57.9%) 有可检测到的改变。因此，研究人员探讨了ctDNA在不同临床阶段对不同癌症类型的检测能力。研究人员发现，ctDNA检测在I-III期疾病中的敏感性>60%，分别为:SCLC (87.5%)、HCC (68.0%)、NSCLC (63.4%) 和宫颈癌 (60.9%)。在IV期疾病中，除肾癌 (63.2%) 和黑色素瘤 (68.2%) 外，> 70％的样本中检测到ctDNA。

血液肿瘤突变负荷 (bTMB) 被作为一种有前景的免疫治疗预测生物标志物。除了SCLC表现出较高的bTMB（与子宫癌相比），子宫癌、膀胱癌、结直肠癌和宫颈癌的bTMB也高于其他癌症类型。甲状腺癌和胶质瘤的bTMB最低。该队列中的bTMB排名与MSKCC2中的相似，但存在一些差异。例如黑色素瘤和胶质瘤在MSKCC中显示出较高的组织TMB排名，但在该研究队列中bTMB排名较低，表明ctDNA脱落可能影响循环肿瘤负荷的确定。基于75%的bTMB百分比，高和低bTMB的临界值设置为8.7突变/Mb。超过一半的SCLC样本被认为是高bTMB (57.0%)。此外，非小细胞肺癌 (33.3%)、膀胱癌 (31.1%)、大肠癌 (29.2%)、宫颈癌(25.8%)也表现出较高的bTMB样本比例，提示不同癌症类型应分别确定bTMB的临界值。此外，bTMB与ctDNA AF正相关，当研究人员根据ctDNA AF将样品分为不同组时，观察到bTMB呈阶梯状增加。这些结果表明，经AF校正的bTMB可能是更好的治疗标记。

由于AF和bTMB的大范围暗示着基因组的异质性，研究人员使用突变等位基因肿瘤异质性(MATH)算法量化了肿瘤的异质性。MSKCC中大多数癌症类型的数学值明显高于相应类型。这表明ctDNA在反映肿瘤异质性方面比单区域活检具有潜在的优势，可能是因为单区活检倾向于忽略低AF引起的一些亚克隆改变。总之，这些结果突出了不同癌症类型之间以及与组织测序数据相比独特的ctDNA特征。

之前的一项研究提供了关于不同癌症类型的假定驱动基因的信息。为了评估基于ctDNA的液体活检和组织活检之间的基因组一致性，研究人员对假定的驱动基因的频率进行了相关分析，显示出很强的线性关系（R2 = 0.87，p < 0.001）。尽管总体上是一致的，但该研究队列的突变态势与MSKCC之间还是存在一些不一致之处。为了阐明这些不一致之处，研究人员进一步将最高突变基因的频率与MSKCC中的频率进行了比较。只有那些具有统计学显著性差异和> 50％倍变化的蛋白才被鉴定为差异基因，以避免由于样本量而产生差异。TP53突变在HCC血浆样本中比MSKCC更常见(53.1%对28.6%)，且与黄曲霉毒素暴露和乙肝病毒感染密切相关的R249S在血浆ctDNA中富集。EGFR突变在NSCLC血浆样本中比MSKCC更常见 (44.8% vs 25.2%)，热点的分布也存在一些差异。


例如，在血浆样本中，外显子19缺失 (e19del) 和T790M的频率更高，而介导对第三代表皮生长因子受体 (EGFR) 抑制剂抵抗的C797S仅在血浆样本中存在。NSCLC血浆样本中KRAS突变频率低于MSKCC (6.8% vs 27.2%) 。值得注意的是，在前列腺癌血浆样本中观察到高频率的AR突变。详细的突变位点分布显示，W742C和T878A在血浆样本中最常见，而L702H和H875Y在MSKCC中最常见。所有这些突变位点都位于配体结合域，并与雄激素剥夺治疗的耐药性有关。这些发现强调了ctDNA在揭示耐药机制方面的优势，并强调了血浆和组织活检之间的相似和差异。造成这些差异的一个可能原因是种族差异。也就是说，本研究中观察到的明显的突变患病率可能暗示了中国患者癌症的致病驱动特征。

以ctDNA为基础的液体活组织检查最有意义的应用之一是寻找药物敏感标记物，并为继续进行靶向治疗的患者确定耐药机制。因此，研究人员使用其大型队列系统评估ctDNA分析揭示的治疗可操作性。研究人员分析了8032个基因组改变的血浆样本，并排除了组织学未知的肺癌和未知的原发癌样本。根据OncoKB数据库建立的标准和其他证据报告，研究人员在3306个样本（41.2%）中检测到4665个潜在药物敏感靶点，其中2299个样本（28.6%）含有1级靶点，100个样本（1.2%）含有最高的2A级靶点，221个样本（2.8%）含有最高的2B级靶点，226人（2.8%）拥有最高级别的3A目标，459人（5.7%）拥有最高级别的3B目标。


半数以上的NSCLC（55.8%）、GIST（54.5%）和乳腺癌（52.7%）样本显示有治疗标志物。在NSCLC、乳腺癌、UGI癌、GIST、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤和结直肠癌中观察到1级标记物。值得注意的是，仅在脑胶质瘤样本中没有可操作的基因变异，这意味着基因组特异性，并强调了中枢神经系统肿瘤的治疗潜力较差。

总结来说，循环肿瘤DNA（ctDNA）提供了一种非侵入性的方法来阐明患者的基因组图谱和可操作的信息。研究人员设计了一个以ctDNA为基础的超过10000泛癌中国患者的研究。使用血浆细胞和白细胞之间的平行测序，14%的血浆细胞游离DNA样本含有克隆造血(CH)变异，其可检测性随年龄增加。


剔除CH变异后，ctDNA在73.5%的血浆样本中检出，其中小细胞肺癌(91.1%)和前列腺癌(87.9%)检出率最高。ctDNA图谱显示的推测驱动基因的情况与基于组织的数据库中的情况相似（R2 = 0.87，p < 0.001），但也显示出一些差异，例如在非小细胞肺癌中EGFR较高（44.8%对25.2%）和KRAS较低（6.8%对27.2%），肝细胞癌中TP53的频率较高（53.1%对28.6%）。高达41.2%的血浆样本存在药物敏感性改变。这些发现可能有助于确定治疗靶点和综合治疗策略。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-020-20162-8

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