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一个PCR反应过程分为很多的步骤，同时也受到很多因素的影响，可以分为内部因素和外部因素，内部因素是指正常试剂体系中的成分，外部因素是指环境或者样本带入的因素。
 体系内部因素
引物：引物是整个PCR体系最重要的部分，也是决定一个PCR反应特异性的关键，引物在设计时要遵守一定的原则（长度、扩增跨度、碱基等）。
酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠杆菌合成的基因工程酶，酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，一般配置成体系需将其调节至7.0-7.5，正常情况下4种dNTP的浓度应该相等，如果其中某一种过高就会引起错配，浓度过低又会引起PCR产物的产量。
模板核酸（靶标）：模板核酸的量和纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，对于RNA模板更要注意RNA的降解。
Mg2+浓度：主要影响PCR扩增的特异性和产量，一般要对应dNTP的浓度。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
温度与时间的设置：PCR原理三步骤涉及变性-退火-延伸三个温度点，也就是变性温度与时间、退火（复性）温度与时间、延伸温度与时间。
循环次数：循环次数决定PCR扩增程度，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般温度循环次数在30-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量就越多。
体系外部因素
- SDS:离子去污剂，0.01%即可完全抑制PCR反应，0.005%可显著降低产量
- 苯酚:0.5%即可完全抑制PCR反应，0.2%可显著降低产量
- 乙醇:大于1%的浓度可抑制PCR反应，但在某些体系里又能增加产量
- 异丙醇:抑制作用比乙醇稍强
- 乙酸钠:大于5mM时抑制PCR反应
- 氯化钠:大于25mM时抑制PCR反应（生理盐水无影响）
- EDTA:0.5mM可使PCR产物减少，1mM完全没有PCR产物
- 血红素（heme）-来源：血液，大于1mg/ml抑制PCR反应
- 氯高铁血红素（hemin）：大于0.1ng/μl抑制PCR反应
- 丹宁酸（tannic acids）：大于0.1ng/μl抑制PCR反应
- 肝素：大于0.15IU/ml抑制PCR反应
- 尿素-来源：尿，大于20mM时产生抑制
- 腐殖质-来源：土壤，植物材料，自然界水
- 植物多糖-来源：粪便，植物多糖
- 聚苯乙烯，聚丙烯-来源：紫外线照射塑料管
- 胆酸盐-来源：粪便
- 胶原质-来源：组织
- 靛青染料-来源：粗斜纹棉布，牛仔裤
- 蛋白酶-来源：牛奶
- 钙离子-来源：牛奶，骨头
- 铁离子-来源：血液
- 二甲苯胺
- 溴酚兰
- 胆红素（bilirubin）
- 其他抑制剂
除上述抑制剂外，还存在一定的PCR增强剂，比如甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、PEG、亚精胺和单链DNA结合蛋白等，但是在高浓度情况下，也会对PCR产生抑制，因此如何采用增强剂消除抑制剂的影响，采用多少的浓度对结果都存在很大的影响。
临床PCR常见问题
1 假阳性问题 方法学问题：靶基因序列特异性、引物错配、非特异性扩增污染问题：样本污染、产物污染解决办法：严格区分试验区域及人员培训，使用UNG技术
2 假阴性问题 问题来源：试剂因素、操作因素、仪器因素、标本因素解决办法：设置阳性对照监测试剂问题降低操作难度，提高操作人员水平室内质控、室间质控监控使用抗干扰能力强的试剂提取样本------------------------------------------------------------------------------ | 
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发表于 2020-10-28 22:20:37
