|
前言 经过上次的学习，我们知道ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）是一门利用抗原抗体相互作用来定量蛋白、荷尔蒙、抗体或病毒抗原的技术，远在1890年，德国医学家Behring在动物的血清中发现了一种可以抵抗白喉的抗毒素物质，进而发展了毒素-抗毒素体液学说并在1901年拿下了诺贝尔奖，1897年体液免疫学之父Paul Ehrlich提出了钥匙理论，打开了免疫学的大门，1960年，Edelman和Porter完成了抗体的氨基酸测序，将抗体结构真实的摆在了人们面前，也因此拿下1972年的诺贝尔奖，此后，免疫测试方法便开始迅速的与科学研究相结合，每年的相关论文发表数量与日俱增（图1），经过十几年的摸索与改进，现共有四种ELISA技术，即ELISA直接法（Direct ELISA）、ELISA间接法（Indirect ELISA）、ELISA夹心法（Sandwich ELISA）以及ELISA竞争法（Competitive ELISA），今天我们一起来了解最早问世的ELISA直接法。
图1 1976-2020年ELISA相关论文发表数量
ELISA直接法简介这是Perlmann最早建立的ELISA方法，通常用于检测分子量比较大的抗体或抗原，以及抗体筛选和抗原表位作图，相比于其它的ELISA检测方法，ELISA直接法是出现最早也是操作最为简单的一种技术，待检测抗原直接包被在通量板的微孔中，加入相应的酶标记抗体和底物，使之产生显色反应，这个方法非常的受用，因为其操作步骤和所需试剂较少，减少了很多的非必要的失误和浪费，ELISA直接法也因为不需要二抗使得它的灵敏度最低，同时，制备相应的酶标记抗体需要非常多的时间，因此ELISA直接法常常只用来做抗原抗体的亲和力检测，对其进行筛选。
图2 ELISA直接法
ELISA直接法操作步骤ELISA直接法的操作大致上分为一下几步，抗原的固定化，洗去未结合的多余抗原，封闭液的再包被，洗板，加入抗体孵育，洗板，加入底物孵育，洗板，酶标仪检测。
图3 ELISA直接法的操作流程
1， 抗原的固定化
在进行抗原固定化之前，需要对酶标板材进行筛选，一般的酶标板材说明书都会根据高结合力，中结合力进行划分，也会以亲水，弱亲水，未处理和疏水四个类型进行区分，酶标板由亲水到疏水，对蛋白的结合会由强变弱，造成吸附能力的差异，所以需要根据不同的抗原对酶标板板材进行考察。
1.1 包被液（Coating buffer） ELISA直接法的第一步就是要选择合适的包被液，这一步非常重要，抗原通过长时间孵育，因疏水相互作用被动吸附到板上，当然，吸附也受其它因素的影响，例如时间，温度，包被试剂浓度以及包被液的PH等等，孵育完成之后需要用洗涤液洗去未结合的多余抗原。
表1 抗原包被影响因素 | 合适条件 | 包被液 | 常用碳酸盐buffer或PBS buffer | 加入体积为50-100uL | 抗原浓度 | 配在包被液中 | 使用浓度为1-10ug/mL | 孵育时间和温度 | 4℃过夜或者37℃反应1-3h |
1.2 封闭液（Blocking buffer） 对于抗原固定化来说，封闭液的再一次包被是必不可少的，在抗原固定化之后，表面仍会有较多的位点并未结合抗原，这很容易造成灵敏度缺失和背景干扰的问题，加入适量封闭液，封闭孔表面未被抗原占据的位点，减少检测抗体被非特异性结合的几率。一些与检测抗体无关的蛋白或表面活性剂常用来作为封闭试剂，例如BSA，脱脂牛奶蛋白等等，37℃封闭两小时或室温封闭过夜都足够完成板表面的封闭.
图4 微孔板封闭
2， 洗涤液（Wash buffer）
ELISA操作中洗板非常关键，由于长时间的孵育，非特异性的结合会增加，这时候需要洗涤液来洗去非特异性结合的蛋白或抗体，通常为PBS，洗3-5次，每次孵育30s时间基本上可去除没有结合的非特异性分子，从经验上来看，多的洗板次数比长的洗板时间更有效，在最后一次洗板时，注意倒压板，吸去多余的液体，同时注意让板子保持湿润,也不要产生太多的气泡。
3， 标记抗体检测
常用的抗体标记酶为碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP），AP催化底物PNPP产生水溶性的黄色产物，可在405nm读取，而HRP可以特异性的催化其底物TMB、ABTS或OPD，释放发色产物，在相应的波长下读取吸光度，TMB是最常用的，因为其反应非常灵敏，可最大程度放大信号。在加入适量的标记抗体后，在室温孵育一小时，保证的抗原抗体的充分结合，之后加入适量底物，室温孵育两小时后继续检测荧光读数，整个实验过程完成。
图5 检测抗体图
4， Trouble shooting
然而实验过程并非如文字描述的那般痛快，很容易出现一些细节问题，如酶标板洗涤不 彻底造成阳性结果，如反应时间过长造成的酶标板整体背景偏高等等，我们必须针对这些实验结果做出一些靶向性的方法处理，总结如下表：
表2 Trouble shooting
图6 ELISA直接法总结（使用MindMaster）
ELISA相关产品一览
随着ELISA技术的进步，慢慢的渗透到了疾病诊断与科学研究领域，市场前景一片辽阔，许多公司将其进行了商业化，其中包括OUSAID、sino biologics、thermo fisher、Abcam、Linco research以及R&D System等等，R&D System经过40年的发展，已经成为全球ELISA试剂盒的顶尖供应商，产品质量可靠；Abcam在中国的产品线包括一抗、二抗、免疫测定以及细胞检测试剂盒等等，检测灵敏度享有口碑；Multisciences拥有广泛的生产线，抗体种类达两万种以上，市场上获得了非常好的反响。
洗板机逐渐成为ELISA操作中不可缺少的仪器，已经被许多药物研发公司规定必须使用，所以一个质量安全性、操作性、稳定性都有保障的洗板机变的很重要，BioTek的微孔板洗板机深受好评，其中ELx405具有非常高的性价比，也是常规ELISA分析中最有效的洗板工具；thermo fisher的Wellwash Versa洗板机可以有效的移除微孔板内的液体，极低的残留量保证了ELISA分析的灵敏度，以及不容易出现假阴性和假阳性的结果；其中还有Molecular Decices的AquaMax洗板机以及TECAN的HydroSpeed等等。作为最终的检测仪器，酶标仪也遭遇了许多商家的竞争，以上的公司也都有各自的产品，不再赘述，目前的自动化仪器也越来越受重视，相信在不久的将来，我们能有幸见到自动化分析仪器带来无穷的便利。
总结&展望ELISA直接法作为ELISA方法中最便捷的一种分析方法，且没有二抗引起的交叉活性干扰，同时作为直接的抗原抗体检测，又无法兼顾灵敏度的问题，且每一个标记抗体只针对一个抗原，非常的耗费人工，因此出现了更多的ELISA技术来改进其不足，即便如此，它还是能在浩瀚的药物研发与科学研究领域上站稳脚跟，当然我们也乐于看到其它的ELISA技术的进步，例如近几年的Cell-based ELISA，推动着生命研究领域前进的步伐。
参考资料 1, Aydin S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA[J]. Peptides, 2015: 4-15. ------------------------------------------------------------------------------ End
1700人QQ大群，欢迎加入 1号QQ群：140978441 2号QQ群：951835987
490人微信大群，欢迎加入 群主微信号：1678200596
IVD原料世界--微信公众号
| 
|1号QQ群：140978441|2号QQ群：951835987|Archiver|手机版|IVD原料论坛-抗体世界旗下的论坛
发表于 2020-8-19 13:14:43
