地高辛标记探针技术

长沙瀚辰生物 · 发表于 2024-3-30 18:05:29

本帖最后由长沙瀚辰生物于 2024-3-30 18:10 编辑

1 概述

1988年，德国人Dooley等首次用地高辛标记的探针检测了结合DNA的蛋白质，这种方法操作方便、干扰少，可以在两天内出现结果。DIG系统是在多种应用中标记和检测核酸的首选非放射性技术。该系统基于从洋地黄植物（紫毛地黄和狭叶毛地黄）中分离的类固醇，这些植物是地高辛的唯一天然来源，因此抗DIG抗体不与其他生物材料结合，可确保特异性标记。

地高辛配基标记的核酸探针技术，具有较高的灵敏度，也克服了放射性同位素标记技术所固有的缺陷以及生物素系统的不足之处，加上本身方法的不断改进，日益显示出优越性和广泛的应用前景。地高辛配基标记核酸探针自应用以来，迅速地从检测蛋白质推广到检测细菌、病毒等微生物，甚至开始检测肿瘤和各种激素，逐渐取代了放射性标记探针和生物素标记探针。目前地高辛配基检测体系已广泛用于核酸研究分析的各个方面，如Southern印迹检测特定基因组序列、进行RFLP分析用于基因诊断、基因表达、菌落或噬菌斑原位杂交、固定细胞及中期染色体原位杂交以及生物体液中病毒DNA序列的检测。

以下简要介绍几种常用的地高辛标记物及标记方法和检测原理。

2 地高辛标记物

地高辛配基标记核酸探针方法很多，不同标记方法使用的地高辛标记物各不相同，常用的地高辛标记物有DIG-NHS、DIG-MAL、DIG-11-dUTP等。

① Digoxigenin NHS ester：(DIG-NHS)：核酸探针5'末端的氨基残基；蛋白分子N端氨基或侧链带氨基的氨基酸残基；其他含氨基残基的生物分子。

② Digoxigenin maleimide(DIG-MAL)：硫醇取代的寡核苷酸探针的巯基（-SH）；蛋白分子侧链含巯基（-SH）的氨基酸残基；其他含巯基（-SH）的生物分子。

③ Dig-11-dUTP：随机引入核酸探针中间；或在3’末端加上多个地高辛残基的尾巴。

④ Dig-11-ddUTP：在核酸探针3'末端只添加一个地高辛残基。

3. 地高辛配基标记方法

3.1 寡核苷酸探针标记方法

3.1.1 3'末端标记法

3'末端标记法的主要特点是在每个合成的寡核苷酸(长度为14~100bp)的3'末端只添加一个地高辛残基(DIG-ddUTP)。用此方法标记寡核苷酸时，除末端转移酶外，无需其它特别的寡核苷酸合成试剂，方便快捷。所合成的探针适合于要求探针具有较高的特异性而灵敏度一般的试验，如Southern印迹、Northern印迹、斑点印迹及菌落P噬菌斑杂交实验。

3.1.2 3'末端加尾法

3' 末端加尾法是由末端转移酶在探针3'末端加上数个地高辛残基的尾巴。此方法标记的探针灵敏度较3'末端标记法要高出10倍左右，但由于存在长尾巴，往往会出现较严重的非特异性背景。

3.1.3 5'末端标记法

5'末端标记法是通过化学方法将地高辛标记于寡核苷酸的5'末端。首先在5'末端连接上一个氨基连接臂残基，将合成的寡核苷酸纯化后，再使DIG-NHS与5'末端的氨基残基发生共价结合，从而形成标记探针。这类探针的一个主要优点是其3'端在DNA合成反应中充当引物，使反应产物得以标记。

3.2 DNA探针的标记方法

3.2.1 随机引物法

随机引物法是由美国Johns-Hopkins大学医学院的Feinberg等创立。用DNase I随机切割DNA，分离，收集长约6-8个核苷片段作为随机引物。以DNA为模板，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，加入随机引物，当这些引物各自按碱基互补原则与模板上的不同区段结合后，在Klenow酶的作用下即从引物的3’-OH-end开始合成互补DNA链，即可获得标记的DNA探针。这种方法一般可允许10ng-3μg范围内探针有效地标记。标记前的DNA要经加热变性成为单链，标记效率较高，一般每20-25个核苷酸掺入一个Dig-11-dUTP，标记探针长度可为在200-2000bp不等。

3.2.2 PCR 掺入法

这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq酶的作用下，将DIG-11-dUTP掺入到新合成的DNA链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng)便可直接通过PCR进行扩增、标记。

4 地高辛标记探针的显色检测

地高辛配基（DIG）是一种具有高抗原性的小分子半抗原，地高辛配基标记的生物分子与高亲和力和特异性的抗地高辛配基抗体结合可用于生物检测。对于DIG标记探针的杂交检测，可选用连接有碱性磷酸酶（alkaline phosphatase），过氧化物酶(peroxidase)，荧光素（fluorescein），罗丹明（rhodamine）或是胶体金（colloidal gold）高亲和性的抗DIG抗体共轭物；也可选用不带任何共轭连接的抗DIG抗体和二级抗体。以下简要介绍化学发光、荧光及化学显色等检测方法及原理。

4.1 化学发光检测

抗地高辛-AP(AP，碱性磷酸酶)识别并特异性结合地高辛半抗原，形成酶联抗体-半抗原复合物，再加入化学发光底物AMPPD、CDP Star、APS-5等，通过仪器以记录化学发光信号。

4.2 荧光检测

与化学发光检测类似，荧光检测法是利用FITC、Rhodamin、Cy3、Cy5以及各种新型荧光染料标记的地高辛单克隆抗体和杂交后探针上的地高辛结合，形成抗体-半抗原复合物，直接进行荧光信号检测。

4.3 化学显色

化学显色同化学发光检测的显色原理相同，都是通过类似ELISA实验的程序加以检测，不同的是化学显色加入的是显色底物，在酶促作用下发生反应，于数分钟内产生肉眼可见的不溶性有色物质，然后进行比色。例如，用抗地高辛的抗体和杂交后探针上的地高辛结合，抗体带有碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶（HRP），然后加入碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的显色底物显色，碱性磷酸酶可用5-溴-4-氯-3吲哚酚磷酸盐(也称X-磷酸盐，BCIP)和氮蓝四唑盐(NBT)等显色，辣根过氧化物酶可用AEC等显色。在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。而AEC显色底物则在过氧化物酶的催化下，被氧化氢氧化形成稳定的红色沉淀产物。

5 技术难点

在生产地高辛衍生产品时，合成及纯化过程较困难：

1）地高辛衍生产品合成过程易开环，并且收率比较低；

2）地高辛衍生产品均为化学性质活泼的结构，在生产及储存过程极易降解变质；

3）地高辛衍生产品纯化工艺难度大，纯化过程也易使产品变质，致使产品收率低。

由于地高辛类产品存在的上述问题，导致国内同类产品存在质量低下、批次不稳定的问题，而进口产品价格高昂。

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