体外诊断技术二代测序之工作流程篇

ITL创新器械开发

近年来，高速发展的二代测序技术（NGS）引领临床分子诊断学步入了一个崭新时代。随着NGS技术的进步，科学家能够更好地了解人类微生物组，发现并分析RNA变体，识别病原体、癌症等疾病中的罕见变体。目前的NGS技术能够以比以往更快、更高的灵敏度对DNA进行测序。我们对DNA和RNA进行精确测序的能力在许多研究领域都产生了巨大影响。下面一起来探讨了解下这项技术。

二代测序理论

二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）是目前主流的DNA和RNA测序，该技术使科学家能够确定DNA分子中碱基的顺序。这揭示关于特定DNA或RNA片段的遗传信息。早期的测序方法始于20世纪70年代，当时的技术围绕着二维色谱进行的。1977年， Frederick Sange引入了链终止方法，该方法提供了可靠且可重复的DNA测序能力。这些进展为首次进行全DNA基因组测序铺平了道路。1984年，科学家们使用DNA测序来破Epstein-Barr 病毒，这表明了DNA测序强大的潜力。

20世纪90年代末，出现了新的DNA测序方法。与第一代技术相比，该新技术具有非常高的通量，因此被称为 “下一代测序”。NGS技术具有高度的可扩展性，这意味着它可以通过将整个基因组分割成更小的片段来同时对其进行测序。

这种平行测序方法改变了DNA测序，从而获得各个行业的关注。越来越多的公司正在寻找利用NGS的方法，试图将NGS的潜力发挥至最大。

二代测序工作流程

二代测序的工作流程包括四个基本步骤。在进入测序阶段之前，先从文库准备和簇生成开始。一旦测序完成，专家就可以进行比对和数据分析。下面更深入地研究NGS工作流程的每一步以及整个过程中涉及的技术：

文库准备

NGS从文库准备开始。专家通过将样本分割成较短的序列来创建测序库，以防止测序偏差。特殊的适配器序列连接到每个片段的末端，这使得序列与测序仪兼容。额外的序列，通常称为条形码或索引，也可以添加到样本中。这允许在同一测序运行中对样本进行多路复用，以节省时间和成本。对于RNA测序，RNA必须首先转化为cDNA。制备的文库可以使用实时PCR进行QC检查，以确认DNA的质量和数量。这允许将正确浓度的样本加载到测序仪上。

集群生成

下一步是将库加载到流动单元中。在这里，每个片段都经过扩增，形成不同的簇群。这一过程被称为簇生成，并产生数百万份单链DNA。聚类生成完成后，样本就可以进行测序了。

测序

DNA测序可以使用几种公认的方法进行：焦磷酸测序、合成测序（SBS）、连接测序或离子半导体测序等。选择的方法取决于所需的化学性质，通过乳液PCR或测序仪本身（桥PCR）对文库片段进行克隆扩增。

数据分析

分析方法取决于研究的目的。许多现代NGS仪器提供了自动化过程的分析工具，如序列比对或数据可视化和解释。生成的数据文件将根据所使用的工作流程进行分析。

下一代NGS技术通常比替代测序技术具有多个优势，包括以快速，灵敏和经济高效的方式生成测序读数的能力。下一篇文章继续探讨下一代测序技术及其应用方面的进展。