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1、为啥要进行封闭？
在体外诊断领域常用的方法学中，无论是免疫层析或是板式ELISA，胶乳免疫比浊或是磁微粒化学发光，或是更新的微流控技术，只要涉及了固相介质及免疫反应，都需要考虑由于反应体系中的蛋白质或生物分子与固相介质间的非特异性吸附，而给反应的特异性和灵敏度带来的负面影响。为了阻止这种非特异性吸附，使用不会参与反应的物质对固相介质表面进行封闭是一种很有效的方法。简单地说，在免疫学实验中，通常使用封闭剂来减少非特异性结合。
固相载体表面(如ELISA板，NC膜或者PVDF膜上等)有很多洞洞，通过电转或包被，胶上的蛋白被转移到了膜上，或抗原/抗体固定在板上，蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。
蛋白塞进了表面的很多洞洞里面，但蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样，就会有很多非特异性的信号。
封闭液中的蛋白可以与表面上的空白位置结合，同样以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上，因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异结合，所以有“封闭”的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够很牢固的结合在空白位置上。这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。
封闭剂应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白、不结合靶蛋白表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。
2、理想的封闭剂应该是这样的：增强信噪比，降低非特异性结合，支持稳定
可以有效的阻断蛋白质等生物分子结合到固相介质表面 不影响已包被到固相介质表面的试剂的有效性 不与反应体系中其他试剂有效成分发生交叉反应 不具有影响反应底物增强或减弱信号的能力 可以起到固相表面偶联分子稳定剂（防止变性）的作用 批间差小
3、常见的封闭剂
3.1 脱脂奶粉
脱脂奶粉含有牛奶中的多种蛋白质，如乳清蛋白和酪蛋白，是最常见的封闭剂之一。像WB和ELISA板等固相表面空洞大小不均匀，不同分子量蛋白种类多的奶粉蛋白(BSA只是一种蛋白)，封闭起来更全面。
价格便宜，易制备，因含多种不同分子量的蛋白，故封闭起来更全面。 缺点：成分复杂，适用范围窄。不适用于生物素和碱性磷酸酶标记的抗体系统，由于牛奶中含有磷酸化的酪蛋白，可被抗磷酸化酪氨酸的抗体识别，导致抗体的非特异性结合进而形成高背景结果，因此在检测磷酸化蛋白时，不建议使用脱脂奶粉。此外使用含有生物素（Biotin）的检测体系时，也不能使用牛奶，因为牛奶也中存在Biotin。且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的生产中较少应用。
3.2 BSA
BSA 成分单一适用于大多数情况。常用浓度为 1% ~ 3%。BSA的售价较便宜，且可在4℃下以固体形态干燥保存或用灭菌水配成溶液保存。BSA用作封闭剂已获普遍认可，其可很好地与中、高吸附强度的固相载体表面结合，且与蛋白A相容。
BSA的售价较便宜，易配置，成分相对单一。
存在批间差异性，主要由所含脂肪酸引起，故 BSA 用作封闭剂时应尽可能地降低其中的脂肪酸含量；含有磷酸酪氨酸，会与抗磷酸酪氨酸抗体发生交叉反应；若免疫原是偶联BSA的， BSA有很强的免疫原性，会导致产生很多的针对BSA的抗体，为避免交叉反应，不能用BSA、脱脂奶粉等封闭，可以选用酪蛋白或无蛋白的封闭剂封闭；不能封闭离子型、共价型和具疏水性的固相载体表面。
3.3 酪蛋白
和BSA作用类似，普通酪蛋白不易溶解。中性和碱性条件下带有负电性，与同样带负电荷胶体金之间存在排斥力，而膜一般都是带正电荷，会与酪蛋白有一定的吸附作用，用酪蛋白封闭效果好些。
成分单一，比较常见，对于BSA不适用的情况建议选用。
普通酪蛋白不易溶解，必须知道casein就是一种磷酸化蛋白，因此不能用于磷酸化的检测。
3.4 鱼胶
鱼胶蛋白为小分子多肽，相比于大分子蛋白，与转印膜结合效果效果好、封闭效率更高，可有效降低因封闭不足导致的高背景；鱼胶相比BSA和牛奶，不会与哺乳动物蛋白质发生交叉反应，能有效降低背噪，提高信噪比，增强抗体信号，为抗原-抗体结合提供了绝佳的反应环境，能节约抗体使用；预混TBST，加入蒸馏水2分钟速溶，可在15分钟左右快速完成封闭操作并能保证与常规封闭剂相同的效果，大幅缩短封闭时间。
鱼胶蛋白更常用于免疫组织化学，在WB实验中，2%鱼胶蛋白可用作封闭剂。
由于鱼胶含有内源性生物素，它不能与Biotin检测系统一起使用。
3.5、 血清
封闭剂血清的原理主要有两点，第一是待检样本会有些与蛋白非特异性结合的物质，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。
免疫组化中用血清封闭的较多。封闭血清不能含有目标蛋白，且与一抗来源不同，一般选择和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合， 会造成背景。另外二抗因尽量少选取兔子或老鼠来源的，因为这两个在亲缘关系上和人类非常接近，所以产生交叉反应的机会就比较大，从而导致背景比较高。适合选用来源于驴，山羊，绵羊等的二抗/血清，背景相对就很低。
特别注意，某些封闭血清中可能含有叠氮钠，因此不适用于HRP酶标的检测体系。
3.6 非蛋白物质
甲醛：可与聚偏氟乙烯制固相载体表面的微结构反应或结合，使之失去与蛋白结合的疏水力或空间结构域。
Polyvinylpyrrolidone (PVP)：是一种非蛋白类的水溶性聚合物，也是一种常用的封闭剂。可以结合NC膜或PVDF膜，与其它封闭剂联合使用，起到封闭作用。尤其对于小分子的检测，大分子量的封闭剂的空间位阻，会影响小分子的结合。像PVP这样的封闭剂有很多，比如PVA，S7，S9等表面活性剂。
去污剂(吐温-20)：有抗原修复的作用，与膜疏水性吸附，有很强的对非特异性吸附的洗脱作用，同样可以降低蛋白间的疏水作用，可提高特异性抗体的识别能力。吐温 -20 是一种非离子型去污剂，有使抗原复性的作用，可为固相载体表面疏水性吸附，具有很强的非特异性吸附洗脱作用，同时可降低蛋白间的疏水性相互作用，提高特异性抗体识别能力。不过，吐温 -20 封闭液的封闭效果不稳定，易被水或缓冲液洗脱。因此，在吐温 -20 单独用作一种封闭剂时，后续操作中的稀释液和缓冲液里均应有一定量的吐温 -20 成分。吐温 -20 与蛋白类封闭剂联用可洗脱其他已非特异性结合至固相载体表面的杂蛋白，此在ELISA 中非常有用。但在脂多糖的测定中不能使用吐温 -20 封闭液，因两者间会发生交叉反应。
尤其是在侧向层析产品中，应用相当广泛。非蛋白类的封闭剂还包括糖类，蔗糖以及PEG也是一种很好的封闭剂，除了具有良好的封闭效果，还会起到稳定蛋白的作用。
3.7 还有一类特殊的封闭剂属于特殊的有针对性的的封闭，最著名的就是HAMA
免疫分析中出现问题的一个常见原因是干扰性抗体，如众所周知的人抗鼠抗体（Human anti-mouse Antibodies，HAMA）、一般的抗动物抗体、嗜异性抗体（Id）或类风湿因子（rheumatoid factors，RF）。
一般来说，这些抗体干扰主要发生在夹心法的免疫分析中，即基于捕获抗体和检测抗体。干扰性抗体可以交联捕获抗体和检测抗体，导致假阳性结果。
或者，它们可以阻止抗原与检测抗体的结合，甚至引起检测抗体的聚集，导致假阴性结果。由于这种封闭剂的针对性很强，一般情况下都称之为“阻断剂”，中文用词讲究。------------------------------------------------------------------------------
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发表于 2022-8-30 15:55:15
