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在新冠疫情之后，如果谈到胶体金，不单是专业人员对它不陌生，就连隔壁的王奶奶恐怕也是耳熟能详了。本想做一些相关科普宣传，但是现在看来确实已经没有那个必要了。
现在唯一能做的是和专业的人员进行一个更加深入详细的探讨，对于过去我们曾经忽略的，或者有些困惑的有关胶体金的问题，进行抽丝剥茧说个明白。我称之为专业闲聊。
每次看到有关胶体金检测方面的文章或书籍，第一句大部分会说1972年，G. Frens的枸橼酸的制备方法。其实，胶体金的制备是起于更早公元四世纪古罗马，用胶体金作为玻璃染色剂，会使得杯子的颜色随光线的方向而变化，公元六世纪，就有人写了一本书，专门介绍用胶体金来染色玻璃的方法，也有人开始将胶体金用于医学用途。
著名莱克格斯杯（Lycurgus Cup）是一个4世纪时的罗马玻璃笼子杯，使用分色玻璃制作。按不同的光线方向，杯子呈现不同的颜色。若光线来自后方为红色，前方时为绿色，甚为魔幻。
而真正的胶体金制备方法应该是1857年Faraday发明的，他用白磷来还原氯金酸，获得了胶体金，那时候叫做activated gold，而且发现这种金溶液中是由金颗粒组成。
既然是金颗粒，那么为什么会溶于水，又叫做胶体金呢？接下来让我们要了解一下有关“胶体“的概念。
胶体（colloid），是指一种不溶解的物质微粒在另一种物质中的分散和悬浮状态。有时特指在液体中的物质分散状态。但是有时也指气体和固体，比如气溶胶，固体凝胶等。
胶体为什么能够处于一种悬浮状态呢？认为有四种作用力在起作用： - excluded volume repulsion
- 静电作用
- 范德华力
- 静力
所谓的稳定性是指胶体保持悬浮状态的能力，维持胶体稳定的主要是静电作用和范德华力，因为这两种作用都是完全不需要能量加持的。
胶体状态的维持必须是颗粒之间的吸引力小于k*T，k 是Boltzmann常数，T是温度。如果满足了这个条件，颗粒之间就只有排斥的作用和微弱的吸引作用，那么颗粒就会处于稳定悬浮状态。
要注意，胶体是一种颗粒的悬浮状态，这和溶液不是概念，如果通过超速离心，可以将颗粒沉淀下来，而溶液的溶质是分子状态，没法离心沉淀。这就是胶体金和葡萄酒的区别。
再回到胶体金的话题。
1972年 Frens用枸橼酸法制备了20nm的胶体金，确实是这个话题最多的开场白，但是，他也是改良了1951年其他人的制备方法。Perrault和chan在2009年用氢化苯醌制备胶体金，作为Frens方法的补充，可以将以前的10-20nm的金颗粒直径做到300nm的范围。
胶体金在医学上的应用最早是标记抗原用于电镜的观察，主要是因为它可以和抗原，抗体，糖，以及核酸相结合。
在生物医学上面的应用也很多，比如药物传递，基因治疗等。但更多的是作为生物传感器，如SPR表面等离子共振的金膜。拉曼光谱增强剂等等。胶体金在医学上的用途很多，在此不再赘述。
我们主要是讨论胶体金在免疫层析检测中的应用。胶体金标记抗体或抗原的原理主要是金颗粒的静电吸附作用和蛋白质结合。
因此，要达到好的结合效果，蛋白质所带的电荷是一个重要的因素。所以在标记的时候要根据不同蛋白的等电点选择不同的PH值进行标记。
等电点（PI），是我们搞蛋白研究的人必须了解的概念，一般情况下，在PH值等于PI的状态下，蛋白质的净电荷等于零，高于PI时蛋白带负电，比较适合胶体金标记。
胶体金制备（烧金）：书上对于这方面的描述也不少，但是基本上都是互相抄写的。什么白磷法，枸橼酸法，葡萄糖法，抗坏血酸法。可以这样说吧，我们这个专业，除了枸橼酸法，90%的人没有用过其它的方法。基本上没什么用。
枸橼酸方法是一种还原反应，枸橼酸的多少与最终的金颗粒直径有关系。大多数书上都会有一张表和彩色的图片：这两个插图相当著名，令人印象深刻。一般来讲，写胶体金书的作者基本上都不是烧金人，烧金人也没机会写书。
虽然理论上是这样，枸橼酸和氯金酸的比例决定了金颗粒的直径。但是，实际应用中10-40nm的颗粒用此方法还比较稳定，如果粒径过大，保持粒径一致就比较困难了，制备更大的颗粒就必须采用其他的方法。
烧金的人的另外一个追求，或者称为梦想，就是获得所谓高质量的金颗粒，“高质量”一词在此应该是大家心中的绝对的均一性。谈到均一性的问题，大部分书上也会有一张插图，就是胶体金的紫外吸收图谱。
至于书上谈及的用电镜来评价金颗粒的质量，还配备一张精美的电镜图片，我只能说是纯粹的纸上谈兵。除非是大型院校和研究所在做课题研究，否则，99%的厂家不会用电镜来看胶体金颗粒，用不起，不现实，也没那个必要。
很多的技术员为了获得高质量的胶体金，在方法上着实下了不少功夫，包括我们早期也很迷恋那种骚操作。
例如改变加入溶液的步骤和方法，恒定温度控制，用旋蒸仪代替搅拌子等等，希望均匀一致的金颗粒能够保证产品的一致性，减少批间差。但是，一切的努力最终都收效甚微。相反，实际应用中，有时通过大小不同的金颗粒混用，反而会使检测的反应曲线变得更加柔顺。
按照数学理论上的逻辑，同样质量的球形金颗粒，粒径小的应该具有更大的表面积，应该能够包被更多的蛋白，因此检测的灵敏度也会更高一些。这个理论因为有数学的加持，显得无懈可击。
然而，事实上并非如此。为什么呢？因为小颗粒的金往往是橘黄色。大颗粒的金，其色系往往偏紫，有时达到深紫色。而最终形成线条的视觉信号十分强烈，很容易用肉眼观察到。似乎更加灵敏。
因为灵敏度的判断来自于颜色信号，视觉的效果不容忽视。包被抗体再多，看不见也无济于事。胶体金的粒径色系问题，始终是一个绕不开的坑，这给后面的定量检测埋下了一个大大的雷。这个话题后面再讲。
在制备胶体金的过程中，我的体会是，其关键点是胶体金的稳定性，也就是说制备的金在很长时间内不发生聚集！而在制备的过程中，细节往往是成败的关键。
过往的经验表明，烧金的容器十分重要，- 一是容器的材质，玻璃器皿是首选。
- 二是容器的清洁度。
目前，很少有实验室采用经典的浓硫酸和重铬酸钾的方法来清洗玻璃容器，取而代之的是用大量的洗洁精，洗洁精是啥？就是表面活性剂，这些残留的物质是胶体金的大敌。
另外，水的质量也是一个重要的因素。去离子水的衡量方法就是电导率。所以，体系考核中，老是揪住电导率来搞事，水的质量一致是一个热衷的话题。
标记方法：金制备完毕后，不能急于标记。还要做三件事：
- 标记什么蛋白，查一下这个蛋白的等电点PI，要选择高于等电点的PH值进行标记。
- 调节胶体金的PH值。
- 高盐破坏实验，以确定标记蛋白的饱和量。
调节胶体金的PH值不是采用传统的酸碱滴定方法，因为强酸强碱往往会破坏胶体金颗粒，大部分都是使用0.2M碳酸钾来调节。
破坏实验的原理是基于高浓度的NaCl对于裸露的金颗粒会有破坏作用，胶体金就会变紫色。
如果金颗粒表面包被了足够的蛋白以后，NaCl就无法破坏金颗粒，颜色仍然呈现红色。根据蛋白包被的量，就可以确定一个最佳的标记浓度。
标记好的金，必须要有一个封闭的步骤，封闭的物质很多，有蛋白质，小分子物质，聚合物，表面活性剂等等。
封闭的目的一个面是封闭金颗粒表面未接合的位点，另一方面是维持胶体金的稳定性。封闭剂的选择，也是大有学问（下回分解）。
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发表于 2022-6-29 21:53:52
