在生物体内，核酸分子（包括绝大多数的DNA和RNA）通常是机体存储、传递各种遗传信息和机体应激反应信息的载体，而最终具有执行功能（如显现先天性遗传缺陷、机体受药物刺激后反应）的基本单元是核酸所表达出的各种功能、结构、数量不尽相同的蛋白质。也就是说，对蛋白质的直接检测和鉴定对于生物体自身性质和变化状况的研究而言，是最具有说服力的。利用DNA芯片所进行的基因表达分析、疾病诊断和药物筛选等方面的研究只能局限在mRNA的水平。而mRNA的表达水平和生物体内由这些mRNA最终所表达出的蛋白质的水平并不是完全成线性关系的。
随着生命科学，尤其是与人类健康息息相关的医学和药学的发展，在蛋白质水平进行检测和鉴定的需求日益增加。2001年，举世瞩目的人类基因组计划对30亿对人体基因组DNA碱基序列测定工作已经完成，除了功能基因组学(functional genomics)外，科学家们已开始将注意力转移到蛋白质组学(proteomics)的研究上来。有意思的是，20世纪50~60年代，生命科学的研究重心由以酶学为代表的蛋白质领域转移到核酸研究领域，现在生命科学的研究重心重新由核酸领域转移到蛋白质领域。传统的酵母双杂交方法、Western印迹法、免疫印迹(immonoblot)法、酶联免疫吸附法(ELISA)等传统的蛋白质科学中的常用技术大多存在着操作繁琐、费时费力、不能大规模并行处理样品的缺点，二维蛋白质电泳倒是可以一次大批量地检测蛋白质样品，但是操作复杂，重复性差，二维蛋白质电泳仅仅可以有效地分辨生物体中中高丰度表达的蛋白质样品，而很多疾病相关的重要蛋白质的表达量都比较低；二维蛋白质电泳还需要对电泳后的蛋白质进行进一步的鉴定，不能立刻得到结果。
和功能基因组学的要求相似，蛋白质组学的研究也迫切需要一种能够快速、准确、并行处理蛋白质分子（如能够检测蛋白质一蛋白质、蛋白质一核酸、蛋白质一脂类以及蛋白质一其他分子的相互作用，对蛋白质表达水平进行测定、比较等)的方法。蛋白质芯片继承了DNA芯片快速、准确、并行检测等优点，在生命科学、临床医学、药物开发、司法鉴定、卫生监测等领域均具有重要的应用前景。
一、蛋白质芯片制备技术
蛋白质芯片的制备技术与核酸芯片类似，主要包括基质材料的选择和处理、探针的选择以及把探针排布到基质材料上的方法。
01 基质材料的选择和处理 蛋白质芯片的基质材料可以选择聚丙烯酰胺胶、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、硝酸纤维素膜、载玻片、硅片、纸、PDMS和金等。根据所选择的基质材料的不同，应采用不同的方式对基质材料进行预处理。固定蛋白分子的方式包括吸附、共价键合、分子自组装等。
意大利Bologna大学的Roda等人使用HP51629A型打印机的喷墨头直接用热喷印法将蛋白质溶液分配到纸上以制造蛋白质阵列。其中使用的蛋白质溶液是1mg/mL的辣根过氧化物酶(HRP)溶液（溶解于0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液中，pH8.6)，并加入了SDS降低蛋白质溶液的表面张力以达到原先使用的墨水的表面张力值。他们先后试验了纤维素纸、纤维素滤膜、尼龙膜、照相用白凝胶纸和喷墨透明薄膜，发现只有纤维素纸的效果较好，酶和纤维素纸的结合方式可能是物理吸附。进一步的试验表明抗体IgG和IgM也可以使用这种方法喷印到纤维素纸上，并且保持蛋白质活性。
美国阿贡国家实验室和俄罗斯恩格尔哈得分子生物学研究所的科学家们所研制的生物芯片称为MAGIC(micro array of gel immobilized compounds)芯片，这一类生物芯片的基质材料采用的是聚丙烯酰胺胶。胶具有荧光背景低、易于修饰各种化学基团、吸附量大的优点。其中蛋白质芯片所使用的聚丙烯酰胺胶的配方为3%的丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺，3：1)、40%的甘油，0.002%的亚甲基蓝、0.012%的TEMED，用0.1mol/L的磷酸钠缓冲液配制，pH为7.0。胶配制好以后，用戊二醛含量为5%的PB缓冲液(27mmol/L KCl，14mmol/L KH2PO4，43mmol/L Na2HPO4，pH7.4)室温下活化48小时。再将4ug/uL的蛋白质溶液（溶解于PBS缓冲液中）用机械手排布到胶上，20℃温育24小时，以使得蛋白质上的氨基和经戊二醛活化的胶上的醛基之间形成酰胺键，从而达到固定蛋白质的目的。
德国Max-Plank分子遗传学研究所的Bussow等人所研制的蛋白质芯片的基质材料为聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。这种膜在蛋白质研究领域中很常用，可以吸附蛋白质分子。他们将构建的人胎脑cDNA文库转入表达载体进行表达，再将筛选到的克隆直接原位破胞后转印到聚偏二氟乙烯膜上用相应的抗体进行检测。英国的分子生物学MRC实验室和蛋白质工程MRC实验室的科学家所使用的方法和Bussow等人的相似，但是使用的是硝酸纤维素膜。
载玻片也可以作为蛋白质芯片的基质材料，但是要事先经过一定的化学处理。美国的Genometrix公司的Mendoza等人采用的载玻片处理方法是先用化学试剂氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)(5%的乙醇溶液)浸泡洁净的载玻片10分钟，进行硅烷化反应，再用化学试剂进行进一步的处理，从而便于与蛋白质结合。Harvard大学的MaBeath采用的则是另外一种方法，他们直接采用了美国TeleChem公司的SuperAldehyde载玻片。这种玻片是表面带有醛基修饰的载玻片。蛋白质N端的氨基或是其中赖氨酸所带的氨基可以和载玻片表面的醛基发生共价结合，形成希夫(Schiff)碱结构。也可以先在洁净的载玻片表面覆盖一层BSA分子，再用化学试剂对BSA进行活化。这样BSA中被活化的赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和谷氨酸(Glu)残基可以和点到载玻片上的蛋白质发生氨基偶联或是形成脲的结构。但是这种共价连接方式可能会使得固定于载玻片表面的蛋白质不能保持原始的稳定构象，从而失活。而研究表明，由于蛋白质分子与载玻片表面的连接总是通过少数几个这样的共价键形式实现的，反而有利于蛋白质以各种可能的方式展现在载玻片的表面。2001年，美国耶鲁大学的Synder实验室的Zhu等人制作的世界首张酵母全蛋白组芯片也是使用载玻片为芯片的基底。他们使用高效表达载体表达并且纯化出大约5800种酵母的蛋白，由于表达出的蛋白质都带有His tag，所以他们在玻片表面使用Ni2+进行修饰，通过亲和吸附固定蛋白质分子。
1996年美国Colorado大学物理系的Mooney等人在硅片上通过光化学光刻的方法实现了蛋白质分子的固定。硅片的表面先经过一定处理形成一层二氧化硅，然后加人试剂n-十八烷基三甲氧基硅烷(n-octadecyltrime-thoxysilane：OTMS)，使其在二氧化硅的表面自组装为单分子层。然后利用掩模对硅片表面进行光刻，去掉一部分OTMS。这时加入BSA，OTMS表面可以吸附一层BSA分子，但是去除了OTMS的二氧化硅表面基本不吸附BSA(吸附程度不足OTMS表面吸附程度的2%)。这样在BSA上可以组装上链霉亲和素(streptavidin)，再结合上相应的生物素标记的蛋白质达到固定化的目的。
蛋白质芯片的基质材料也可以用金。在表面化学研究中，科学家们发现金可以和各种生物分子结合。德国的Interactiva公司研制的蛋白质生物芯片XNA on Gold就以金作为芯片的基底。他们在载片上先制作一层100nm厚的金膜，然后在金膜上自组装一层长链的硫醇烃。在硫醇烃的一端连接上链霉亲和素分子，这样，生物素标记的蛋白质分子就可以组装在芯片的表面，从而进行相应的反应及检测。
02 样品的排布 以上实例中样品在基质材料上排布的实现方式大多是先制备好蛋白质样品库，再通过使用DNA芯片中成熟的机械针点样系统或是微量液体分配系统实现。其实，和DNA芯片技术相似，蛋白质芯片也可以通过原位合成的方法制备。但用这样的方法合成小肽的成本比合成寡聚核苷酸更高，因为DNA的组成单元只有A、G、T和C共4种核苷酸，而蛋白质和肽是20种基本氨基酸。如果合成长为5个碱基的寡核苷酸，则需要4×5共计20张掩模板：而合成长为5个氨基酸的小肽，则需要20×5共计100张掩模板。所以几乎无人使用光引导原位化学合成法制备蛋白质芯片。
但还是有不少使用例如固相原位方法合成小肽进行蛋白质检测的工作，例如，早在1984年，澳大利亚Commonwealth血清实验室的科学家Geysen和荷兰科学家Barteling通过在96孔板内合成208种不同的6肽，包含了口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白(213个氨基酸)的所有可能的连续6肽的组合情况，用以确定其上的表位，从某种意义而言，这也可以看作是蛋白质芯片最早的雏形。还有Reuter等用以确定限制性核酸内切酶EcoRII的方法也是这一种。
03 探针的选择 以上实例中排布在基底材料上的固定探针都是蛋白质或是多肽，这是狭义上的蛋白质芯片，广义上而言，只要能够对蛋白质进行快速、并行分析的生物芯片都可称之为蛋白质芯片。那么蛋白质芯片基底上的固定探针就并不仅仅局限于蛋白质，也可以是核酸分子、核酸-蛋白质复合物或者其他的配基、小分子的酶的底物。
例如，由Texas大学Austin分校的Ellington和Brandeis大学的Hedstrom和Stanton合作开发出的基于SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)原理的可以用以检测蛋白质的芯片，基片上的固定探针是核酸分子。
美国的Phylos公司的PROfile Chip中固定在基片上的探针是mRNA-蛋白质复合物。他们对mRNA进行修饰，在5'端加上连接臂和嘌呤毒素(puromycin)。这样，在蛋白质的体外翻译过程中，嘌呤毒素可以将mRNA与其表达出的蛋白质相连接。而且这样的mRNA-蛋白质复合物的热力学性质稳定，解离温度达到110℃。固定也比较方便，首先在基片上固定专门设计的寡核苷酸分子，这样mRNA-蛋白质复合物中的RNA就可以根据Watson-Crick规则与相应的互补寡核苷酸分子连接，从而得以固定。
二、蛋白质芯片检测技术
蛋白质芯片的检测技术主要有与DNA微阵列芯片技术中相类似的荧光或是同位素标记方法，还有原子力显微(AFM)技术、表面等离子体共振(SPR)技术、多光子检测(MPD)技术、基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)技术、表面增强激光解吸附作用/离子化(SELDI)技术等。
01 荧光/同位素检测技术 蛋白质芯片的检测可以沿用DNA微阵列芯片技术中常用的荧光或是同位素标记。例如Harvard大学的MaBeath等人将抗原固定在载玻片上，将能和这些抗原特异性结合的抗体用荧光素标记，如Cy3、Cy5、Alexa546、BODIPY，这样就可以通过检测荧光判定是否发生了预期的特异性结合反应。另外，他们还将蛋白激酶的底物固定在载玻片上，在含有各种蛋白激酶的反应液中再加入带有γ-33P标记的ATP，这样蛋白激酶就可以使底物带上33P标记。蛋白质芯片的检测可以直接使用DNA微阵列芯片技术中常用的扫描仪或是CCD成像。
在DNA微阵列的应用中，标记的通常是靶DNA，即从体内抽提的待检测的总RNA先反转录为cDNA,并在这过程中掺入荧光标记。但是对于从体内抽提的总蛋白而言，并没有与反转录相对应的过程，荧光标记的掺入并不像DNA那么方便，只有在待表达的基因片段中插入荧光蛋白的基因，或是给表达体系提供带有荧光标记的氨基酸，或是体外通过化学方法将荧光基团接到蛋白质上。为了解决这个问题，产生了标记探针的方法。例如，前面提及的Texas大学Austin分校的Ellington和Brandeis大学的Hedstrom和Stanton计划合作开发的基于SELEX原理的可以用以检测蛋白质的芯片，基片上的固定探针是核酸分子。他们发现当连有荧光素的核酸在和特异的配基结合后，由于构象发生一定程度的变化，从而使得荧光素发射出的荧光强度发生变化（大约25%~40%）。这样可以将带有荧光素的核酸固定在基片上，通过检测荧光强度的变化就可以判定分子间的相互作用状况。同时他们发现当连有荧光素的核酸在和特异的配基结合后，荧光基团的各向异性也会发生变化。
也可以通过检测各向异性判定分子间的相互作用。另外，还可以采用分子信标技术，在固定在基片上的核酸分子的特定位置接上荧光基团和荧光淬灭基团，当核酸分子没有和其他分子发生相互作用时，核酸分子形成发夹结构，荧光基团处于淬灭状态。当核酸分子和其他分子发生相互作用时，核酸分子构象改变，荧光基团和荧光淬灭基团不再相互接近，从而发射出荧光。
02 原子力显微（AFM）技术 早在20世纪80年代初，瑞士苏黎世IBM研究中心的科学家Binnig和Rohrer发明了扫描隧道显微技术(scanning tunneling microscope，STM)，在此基础上，1986年，Binnig、Quate和Gerber发明了原子力显微(atomic force microscope，AFM)技术，也可以称为扫描力显微(scanning force microscope，SFM)技术。这项技术可以用于检测物质的表面状况。对力敏感的悬臂梁(cantalever)上的尖端对样品表面作光栅扫描。悬臂与样品表面力的作用会造成悬臂发生微小偏转。这种偏转可以被检测和记录。这样，在探针顶端进行化学修饰，例如加上特定的生物分子（如蛋白质、核酸），用这样的探针对蛋白质芯片的表面进行扫描，就可以检测到这些生物分子与蛋白质芯片表面的蛋白质分子之间的相互作用。这种使用进行了化学修饰探针的原子力显微技术又称为化学力显微(chemical force microscopy，CFM)技术。这项技术的优点是非常灵敏，可以在液相（如生物缓冲液）中进行，样品的用量少，且不需要用荧光染料或是同位素事先标记。但是检测速度比较慢、价格昂贵。美国的BioForce Laboratory公司和Digital Instruments Veeco公司（专门制作各种AFM仪器的著名公司）合作，计划研制出基于AFM技术的NanoArrayer扫描仪，并进一步推出以NanoArrayer为检测工具的ViriChip(用于快速检测生物样品中病毒感染状况）、Proteome Chip(用于快速检测蛋白质-蛋白质相互作用)、Drug Screening Chip(用于快速分析组合化合物库)和Immunodiagnostics Chip(用于快速分析抗原抗体相互作用)。
03 表面等离子体共振（SPR）技术 表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)技术近年来被广泛地用来研究和检测生物分子之间的识别和特异性相互作用，是研究分子识别和分子间相互结合、相互作用的有力手段。其基本原理为，当光线（常常使用激光）在金属表面（通常为金，厚度一般为50~80nm)发生全反射时，一部分入射光的能量转化为沿着金属表面传播的渐消失波(evanescent wave)。金属厚度的变化可以使得发生全反射的角度发生微小的变化。这样，在金属上固定相应的生物分子，如蛋白质，在一定的化学条件下如果固定在金属上的生物分子能够和其他分子相结合，这就等效于改变了此位置金属的厚度。通过检测全反射时反射光角度是否变化，就可以判定是否发生了分子间相互作用。这种技术的优点是灵敏度高，待检测分子用量少，不需预先标记，仪器构造简单，如果自行构建，成本较低。瑞典的BIAcore公司无疑站在这一领域的最前沿，它们研制的基于SPR技术的仪器BIAcore2000和BIAcore3000已经面世。另外，德国的BioTul公司和美国的Texas Instruments公司也有各自的SPR产品问世。
04 多光子检测（MPD）技术 多光子检测(multi photon detection，MPD)技术是由美国的BioTraces公司发明并逐渐发展起来的一种高灵敏放射性同位素检测方法。这种方法通过无源屏蔽(passive shielding)等四项技术来显著降低背景强度，可以检测到10^-21mol的同位素，这样对实验中所需的同位素量的要求降低，减小了实验中可能对人的伤害。并且这种方法可以同时使用并区分两种或是两种以上的同位素标记，便于进行样品的平行比较实验。BioTraces公司和德国的Tubingen大学合作成立了ProteoMed公司，共同进行MPD技术在蛋白质检测方面的研究工作。他们计划将待检测样品和对照样品分别用不同的同位素标记，将样品进行二维蛋白质电泳(2-D electrophoresis)或是使用蛋白质芯片技术，然后利用MPD技术进行蛋白质表达差异显示(differential display of proteins，dd-PROT)的工作，从而得出蛋白表达谱。
05 表面增强激光解吸附作用/离子化技术 表面增强激光解吸附作用/离子化(surface-enhanced laser desorption/ionization，SELDI)技术是由Texas医学中心Baylor医学院的Hutchens于20世纪90年代初发明的。其具体过程为先富集所需的蛋白（如通过蛋白质芯片进行捕获)，再用激光使得蛋白质与芯片表面解吸附，解离为离子，然后通过质谱、亲和色谱-质谱等方法进行定性分析。现在关于SELDI技术的专利共有4项，被美国的Molecular Analytical Systems(MAS)公司所拥有。Ciphergen Biosystems公司和LumiCyte公司得到了MAS公司的授权，现已经研制出使用SELDI技术的蛋白质芯片产品ProteinChip Array和SELDI BioChips。
06 基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱 质谱是一种十分灵敏的检测技术，形象地说，质谱技术是一项通过将待测样品分子用“锤子”敲击为碎片（离子或是中性粒子）并加以检测从而确定初始样品分子性质的技术。在传统的质谱方法中，待测样品分子的分子量通常在10kD以下，所使用的“锤子”一般是高速原子轰击(fast atom bombardment，FAB)和电子溅射离子化(electron spray ionization，ESI)这两种方法，并且通常将样品分子分为许多碎片。
而对于蛋白质而言，通常分子量都在10kD以上，结构复杂，如果被解离得过碎，会给读谱带来困难，为了解决这些问题，1988年Karas和Hillenkamp研制出了基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/mass spectrometry，MALDI-TOF/MS)技术，主要用于对生物大分子（如蛋白质、多肽、核酸）进行分析，可以分析分子量高达1000kD的蛋白质，灵敏度达到10^-15ml。待分析的生物大分子样品和对光敏感的化合物(matrix)，如龙胆酸(gentisic acid)、α-蓝-4-羟基苯乙烯酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)，一起包埋进固体介质中共结晶形成晶体，然后用长波长激光脉冲照射，这样对光敏感的化合物吸收激光能量，使得蛋白质分子离子化，并且几乎不解离为碎片。然后离子被加速后通过飞行管（管长约数米，飞行时间约100ms)分离，进行质谱检测。MALDI-TOF/MS技术的缺点在于待测样品的制备比较困难，要求比较纯的蛋白质样品，并且要选择合适的对光敏感的化合物和固体介质，以使它们可以很好地共结晶。而且这项技术无法进行定量测定，只能定性测定，美国的Intrinsic Bioprobes公司的高通量蛋白质检测系统MASSAY就是利用MALDI-TOF/MS技术进行蛋白质的检测。
蛋白质芯片的新技术、新方法层出不穷。随着蛋白质芯片技术的日臻成熟，必将大力推动蛋白质组学的发展，让我们了解更多的奇妙的生命现象。 ------------------------------------------------------------------------------
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发表于 2022-5-2 20:41:06
