基于新型冠状病毒结构蛋白的诊疗技术的研究进展

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摘 要：近年来，冠状病毒感染人体事件频繁发生，给人类造成了巨大损失。新型冠状病毒（SARS-CoV-2）不仅传播迅速，而且具有致命性，目前已构成全球大流行，导致了数十万人的死亡。因此SARS-CoV-2的及时诊疗十分重要。由于冠状病毒的结构蛋白在病毒复制感染传播过程中发挥重要作用，所以综述了基于此次SARS-CoV-2 4种结构蛋白S、E、M、N的相关诊断治疗预防技术的研究进展，为更好地深入了解冠状病毒的致病机制以及为临床检出和药物疫苗研发提供有力支持。

新型冠状病毒导致的新型冠状病毒肺炎是当前全球关注的公共健康问题。2020年2月11日，这种新型冠状病毒被国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2，同日，世界卫生组织将该病毒所感染的肺炎命名为COVID-19。SARS-CoV-2与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合症冠状病毒（MERS-CoV）都是源自动物的人畜共患病原体。尽管冠状病毒通常与人类急性呼吸道感染有关，但其感染多种宿主物种的能力使其成为复杂的病原体[1]。鉴于冠状病毒的高度流行和广泛分布、其基因组的遗传多样性和频繁重组以及人与动物之间的频繁互动，新型的冠状病毒很可能会定期在人体内周期出现[2-3]，成为人畜共患病感染的常见来源。

SARS-CoV-2传播迅速、危害极大，针对该病毒的及时诊断和有效治疗预防十分重要。SARS-CoV-2是一种RNA病毒，核酸是病毒检测[4-5]和治疗[6]的重要途径。但是由于其核酸RNA的高突变率和不稳定性[7]，因此开发基于病毒蛋白的诊断和治疗相关技术十分必要。SARS-CoV-2的结构蛋白在病毒感染中发挥重要作用，本文主要介绍SARS- CoV-2的4种结构蛋白的结构功能以及它们在病毒诊断治疗预防中的突出应用，为更好地理解诊疗过程中SARS-CoV-2结构蛋白的重要性提供思路。

1  SARS-CoV-2的生物学特征和结构蛋白

冠状病毒是一种有包膜的正义RNA病毒，其特征是具有从其表面突出的棍棒状突刺。SARS-CoV-2是典型的β属冠状病毒，基因序列分别为5'非翻译区（UTR）、复制酶复合体（orf1ab）、S基因、E基因、M基因、N基因、3'UTR和一些不确定的非结构性开放阅读框[8]，包含4个主要结构蛋白，分别为刺突（S）蛋白、膜（M）蛋白、膜（E）蛋白和核衣壳（N）蛋白，所有这些蛋白均在病毒基因组的3'端编码[9]，冠状病毒的结构示意图见图1。

S蛋白位于冠状病毒表面，是典型的Ⅰ型跨膜糖蛋白[10]，组成了病毒表面上独特的穗状结构[11-12]，S蛋白由S1和S2两个亚基组成，S1形成了刺突蛋白的球状头，包含S蛋白的大受体结合结构域N端结构域（NTD）和受体结合结构域（RBD），负责识别宿主细胞受体，而S2形成了刺突蛋白的茎，参与膜融合[13]。S2亚基包含3个功能域，融合肽（FP）和肽重复序列（HR1和HR2），在S1尖端的RBD与受体结合后，S2中的FP插入宿主细胞膜而改变构象，刺激HR1和HR2形成六螺旋束（6HB），导致病毒膜与细胞膜融合[10]。目前SARS-CoV-2 S蛋白的结构已经获得解析[14]。

M蛋白是病毒体中最丰富的结构蛋白，有3个跨膜结构域[15]，可以使病毒体形成其形状。它具有一个小的N端糖基化胞外域和一个更大的C端内域，在病毒颗粒内延伸6～8 nm[16]。M蛋白在病毒体中以二聚体形式存在，并且可能采用两种不同的构象，从而使其既能够促进膜弯曲又能与核衣壳结合[17]。

病毒粒子中存在少量跨膜E蛋白。E蛋白具有N端胞外域和C端内域，并具有离子通道活性，有助于病毒的组装和释放，缺乏E蛋白的重组病毒会造成病毒致命性减弱[18]。N蛋白是存在于核衣壳中的唯一蛋白，它由两个独立的结构域组成，即NTD和C端结构域（CTD），两者在体外可使用不同的机制结合RNA，表明最佳的RNA结合需要两个结构域的参与[19-20]。N蛋白也与复制酶复合物的关键成分nsp3[20-21]和M蛋白[22]结合，这些蛋白质相互作用可能有助于将衣壳化的基因组包装成病毒颗粒[23]。

2  基于SARS-CoV-2结构蛋白的诊断技术

此次SARS-CoV-2潜伏期较长、初时发病症状不明显且传播迅速，因此，实现早期临床高效检出病毒感染是全面控制病毒的一个重要方面。关于病毒检出临床最常用的方法是核酸检测法和免疫学检测法，核酸检测法虽然是检测的金标准，但该方法也存在“假阴性”现象，且具有操作人员限制、易污染等缺点，相比之下基于病毒结构蛋白的免疫学检测抗体抗原法具有快速、方便的特点。对于SARS- CoV-2而言，开发用于检测病毒特异性抗体抗原的免疫学检测方法主要是针对具有高免疫原性的结构蛋白S蛋白和N蛋白[24-26]。

2.1  基于SARS-CoV-2结构蛋白的抗体检测法

病毒抗体检测主要为IgM和IgG，IgM产生早但维持时间短，可作为早期感染的指标，IgG产生晚但维持时间长，可作为感染和既往感染的指标。检测方法主要有化学发光免疫分析法[27]、胶体金免疫层析法[28-29]以及酶联免疫吸附测定法（ELISA）等。解放军中部战区总医院在临床上分别采用最新建立的抗SARS-CoV-2 S蛋白和N蛋白IgM和IgG抗体ELISA法检测患者[30-31]，结果发现这种免疫学检测方法具有很高的灵敏度，特别是对于患病10 d后患者血清样品的检测，因此它可能是COVID-19诊断的重要补充方法。S蛋白通过与细胞表面的靶受体结合，在病毒进入过程中起着非常重要的作用，并有研究显示重组S蛋白比重组N蛋白更利于血清学检测[32]，但S蛋白是一种高度糖基化的蛋白[33]，在哺乳动物细胞中表达S蛋白的成功率有限，因此免疫学诊断多用N蛋白，目前已批准上市的新冠病毒抗体检测试剂盒的检测抗原也主要为N蛋白。

2.2  基于SARS-CoV-2结构蛋白的抗原检测法

由于病毒特异性抗体通常在感染后2～4周内才产生，因此IgM和IgG抗体检测方法对早期病毒的灵敏度不高，而病毒抗原是病毒的特异性标志，在感染者体内出现在抗体之前，所以病毒的抗原检测相比于抗体检测更具有时间优势。有研究在只有基因序列信息的情况下，通过设计合成SARS- CoV-2 N蛋白具有抗原表位的多肽后免疫动物获得抗体，利用夹心ELISA法和基于量子点的快速免疫层析检测法检测SARS-CoV-2 N蛋白。发现ELISA检测限和快速免疫层析检测限均达ng级别，具有较高的灵敏性[34]。解放军中部战区总医院也建立了在10 min内检测患者鼻咽拭子和尿液中SARS-CoV-2N蛋白的荧光免疫层析法，发现该方法不仅具有较高的灵敏性和特异性，且能检测发烧3 d后的早期患者[35]。这表明N抗原测定是一种准确，快速，早期和简单的COVID-19诊断方法，也意味着这种N抗原检测方法不仅可以保证医院的早期诊断，还可以在社区进行大规模筛查。

2.3  基于SARS-CoV-2结构蛋白的抗体抗原交叉检测法

由于抗原检测需要更高的敏感性，而通常样品中含量很低，并且针对病毒的单克隆抗体等研制也需要时间，所以快速检测全病毒抗原的实现需要一段时间。为加快SARS-CoV-2的抗原诊断研究进展，研究人员也在探究SARS-CoV的S蛋白和N蛋白产生的抗体是否可以与SARS-CoV-2的抗原交叉反应。SARS-CoV S蛋白的S2亚基中的免疫原性区域在SARS-CoV-2中高度保守，有研究发现利用SARS-CoV的S2亚单位中的一个免疫原性片段产生的一组鼠单抗可在SARS-CoV-2的感染细胞中检测到S蛋白[36-37]，表明SARS-CoV S2蛋白单克隆抗体可与SARS-CoV-2交叉反应用于临床诊断。同样发现N蛋白抗体也可能与SARS-CoV-2发生交叉反应，虽然不能提供交叉免疫，但是可用于诊断方向[38]。这些结果为SARS-CoV-2的检出提供了一个新方向，提示可利用已有的与SARS-CoV-2保守性较高的SARS-CoV的S2蛋白和N蛋白的特异性抗体检测SARS-CoV-2的抗原，可节省大量的研发时间。

综上所述，病毒的免疫学检测手段主要依靠免疫原性强的结构蛋白S蛋白和N蛋白，且N蛋白由于易表达，在血清学检测中相较于S蛋白应用更广泛。自此次SARS-CoV-2爆发以后，多家公司和科研机构致力于研发抗体抗原检测试剂盒。2020年3月4日国家公布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》将抗体检测纳入诊断标准[39]。截至2020年4月25日，国家药品监督管理局已批准8家抗体检测试剂盒的上市[40]。抗体检测具有检测方式安全、检测快速、高通量、低成本等诸多优势，具有很好的应用前景，但也存在患病早期检出率不高的问题。抗原检测手段具有与抗体检测同样优势，但是研发周期长，需要更高的灵敏度，所以目前临床应用并不广泛。总之，患者病毒感染早期的核酸确认是重要的，但病毒感染10 d以后RNA的阳性率会迅速下降，此时诊断应主要依靠血清学检测。因此为实现最大化的病毒检出效果，应该将核酸检测和抗体（抗原）检测联合使用，互相补充互相辅助，以达到最优的灵敏度、特异性和准确性。

3  基于SARS-CoV-2结构蛋白的治疗药物

目前关于SARS-CoV-2的特异性治疗主要包括病毒蛋白酶抑制剂干扰病毒感染[41]、CRISPR编辑病毒RNA基因组限制病毒复制[42]、S蛋白–血管紧张素转换酶2（ACE2）结合阻碍剂阻止S蛋白和ACE2有效结合以及药物直接作用于病毒结构蛋白从而改变病毒构象功能等方面[43]。本文主要介绍与病毒结构蛋白相关的后两种治疗方法。

3.1  ACE2结合阻碍剂

ACE2是一种Ⅰ型跨膜蛋白，是SARS-CoV和SARS-CoV-2的功能性受体，通过与冠状病毒结构蛋白S作用而介导病毒进入细胞。SARS-CoV-2的S蛋白与人细胞受体ACE2的亲和力是SARS-CoV的10～20倍[14]，并且可能正是由于这种高亲和力使得SARS-CoV-2在人与人之间传播变得更容易。因此药物作用于S蛋白的RBD区从而阻碍病毒S蛋白和受体ACE2结合是治疗COVID-19的一个重要方向。首先思路为利用ACE2变体或部分ACE2结构结合病毒RBD区。Lei等[44]将人ACE2的胞外区以及一个催化活性较低的ACE2突变体分别连接到人免疫球蛋白IgG1的Fc区而产生了两种新的重组蛋白，结果发现这两种融合蛋白都与SARS-CoV和SARS-CoV-2的受体结合域RBD有很高的亲和力，可有效中和SARS-CoV和SARS-CoV-2，发挥了预期的药理作用。这种融合的免疫黏附素形式不仅可以延长循环分子的寿命，而且可以增强免疫系统对抗病毒的效应功能，具有很高的应用价值[45]。Zhang等[46]发现ACE2肽酶结构域（PD）α1螺旋对于结合SARS-CoV-2-RBD很重要，通过合成了针对SARS-CoV-2的RBD区域的ACE2 PD α1螺旋的多肽，发现该肽与SARS-CoV-2-RBD具有高亲和力的特异性结合，因此这种多肽为COVID-19的治疗提供了新途径。其次特异性抗体结合病毒RBD区也是一个重要的治疗思路。中国科学院武汉病毒研究所联合其他机构将通过中国仓鼠卵巢细胞表达的SARS-CoV-2 RBD免疫马并去除所诱导的中和抗体的Fc，结果不仅从超免疫性马血浆中获得了针对SARS-CoV-2的高效价治疗性抗体，而且有可能避免抗体依赖性增强作用，因此这种抗RBD的马免疫球蛋白片段F(ab')2可作为治疗COVID-19的潜在药物[47]。患者恢复期血浆也由于可提供针对RBD区的特异性抗体[48]，从而具有广阔应用前景。同时为缩短药物研发时间，Tian等[49]比较了SARS-CoV S蛋白RBD区的单克隆抗体与SARS- CoV-2的作用效果，结果发现SARS冠状病毒特异性的人单克隆抗体CR3022能与SARS-CoV-2 RBD有较强结合，但结合位点与ACE2结合位点不重叠。因此说明CR3022有可能单独或与其他单克隆抗体联合应用作为治疗COVID-19感染的候选治疗药物，但仍有必要开发能够与SARS-CoV-2 RBD的ACE2结合位点特异结合的新型单克隆抗体。除以上特异性治疗方法以外，根据分子对接技术和结合SARS-CoV的研究经验，氯喹、大黄素、丙嗪、烟碱胺及其他中西药等均可能干扰S蛋白与ACE2的相互作用，有潜在的治疗价值[50-52]。

3.2  直接作用于病毒结构蛋白的药物

药物直接作用于冠状病毒结构蛋白也可以通过改变蛋白正常功能而抑制病毒感染。Yan等[53]对SARS-CoV-2 S蛋白序列进行了生物信息学分析，发现SARS-CoV-2的S蛋白在相互作用面上形成了相邻的由整合素识别的RGD基序，由于SARS- CoV-2的S蛋白与整合素的结合可能促进病毒的感染过程，因此他们提出针对SARS-CoV-2 S蛋白界面的关键残基和相邻的RGD基序作为潜在结合位点进行高通量虚拟筛选的靶向药物nadide有望用于治疗COVID-19。之前有研究报道在SARS-CoV S蛋白S2亚基的HR2区发现了一个抗SARS-CoV的多肽（SC-1），SC-1可与HR1结构域结合形成6螺旋束，阻断S蛋白介导的膜融合，抑制SARS-CoV感染[54]。对比SARS-CoV-2和SARS-CoV，发现两者S蛋白之间的HR2结构域上表现出100%的同源性，在HR1的融合核心发现了7个位于SC-1结合基序的氨基酸的变化，但是由于这些替换是保守的替换，不会显著破坏SC-1和HR1之间的相互作用，所以这意味着SC-1仍然有潜力成为SARS-CoV-2感染的有效抑制剂[55]。N蛋白也可能是潜在药物靶点，Kang等[56]通过表征SARS-CoV-2 N-NTD的晶体结构，发现核糖核苷酸结合区域的几个残基能明显识别冠状病毒RNA底物，该发现有助于干扰SARS-CoV-2中病毒N蛋白和病毒复制的药物开发。Ge等[57]提出目前处于I期临床试验的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）抑制剂CVL218可能会被重新用于治疗COVID-19，分子对接模拟表明CVL218可能与SARS-CoV-2 N蛋白的N端结构域结合，可能会抑制病毒复制和阻止核衣壳蛋白与病毒RNA的结合从而抑制病毒的生长。同时SARS-CoV-2的包膜E蛋白也有治疗潜力，E蛋白具有两个完全保守的关键功能特征，一个离子通道和一个PDZ结合基序（PBM）[58]。批准用于人类的金刚烷胺、六亚甲基阿米洛利和SB2035805 3种药物的前两种可作用于离子通道，后一种作用于PBM，可能会抑制SARS-CoV-2 E蛋白的正常功能[59]，从而提升患者存活率。

SARS-CoV-2的感染趋势不断扩大，关于治疗药物的研究也从未间断，但目前临床使用的更多是现有广谱抗病毒药物，由于缺少特异性抗SARS- CoV-2作用，可能导致严重不良反应，因此开发针对SARS-CoV-2的特异性药物至关重要。冠状病毒的结构蛋白是病毒治疗的主要药物靶点，通过作用于结构蛋白可阻碍病毒与受体结合以及改变病毒正常功能，从而实现特异性治疗，具有很好的应用前景和研究潜力。

4  基于SARS-CoV-2结构蛋白的预防疫苗

疫苗的研发对于从根本上预防冠状病毒至关重要。病毒疫苗主要包括全细胞灭活疫苗和减毒活疫苗、亚单位疫苗、mRNA疫苗、DNA疫苗、活载体疫苗以及合成肽或表位疫苗等多种形式。由于冠状病毒的S蛋白在介导受体结合以及进入宿主中起着主要作用，是中和抗体的主要靶点，因此除灭活/减毒活疫苗设计针对病毒整体以及合成肽或表位疫苗设计针对病毒4种结构蛋白的多个抗原表位外，其他形式疫苗设计主要针对S蛋白。

4.1  针对S蛋白的疫苗

Trevor等[60]报道了一种针对SARS-CoV-2 S蛋白的合成DNA疫苗INO-4800，工程构建的INO-4800在体外诱导了S蛋白的大量表达，并在小鼠和豚鼠中单次免疫后产生抗体和T细胞反应，这一数据初步确定S蛋白的DNA疫苗INO-4800可作为COVID-19的一种潜在候选疫苗。为更好的设计针对S蛋白的相关疫苗，北京航空航天大学和同济医学院的两个团队分别利用免疫信息学方法鉴定了S蛋白的抗原表位和通过分析SARS-CoVS蛋白的冷冻电镜结构[61]，使用同源性建模明确了SARS-CoV和SARS-CoV-2刺突蛋白的表面线性表位暴露列表[62]，这些发现对于疫苗的研发有重要的参考价值。

对比对SARS-CoV感染有效的中和抗体是否对SARS-CoV-2有作用有助于加快疫苗研发进度。对比发现两种病毒最可变的残基位于关键的疫苗靶点S1的受体结合基序（RBM），这意味着对SARS-CoV RBM区感染有效的中和抗体可能无法识别SARS- CoV-2，在排除RBM区后的SARS-CoV-2 RBD区高度保守，所以从SARS-CoV RBM区外的表位产生的抗体有可能既显示交叉反应，又诱导中和抗体[63]。但研究发现SARS-CoV S1蛋白的多克隆抗体与SARS-CoV-2仅显示有限的交叉中和反应[64]，因此仍有必要研发针对SARS-CoV-2的特异性中和抗体。除了S1蛋白，疫苗研发也可以考虑S2蛋白，由于S2蛋白在SARS-CoV-2病毒间具有很好的保守性，因此基于S2蛋白的疫苗设计可以增强广谱抗病毒效果，值得在动物模型中进行试验[65]。

4.2 表位疫苗

冠状病毒疫苗研发除了只针对S蛋白以外，对其他结构蛋白的抗原表位的研究也有助于构建合成肽或表位疫苗。有研究识别出了一组SARS-CoV抗原表位与SARS-CoV-2完全相同，这些表位大量位于S蛋白和N蛋白，具有潜在的交叉反应，因此为指导开发SARS-CoV-2疫苗提供了重要参考[66]。免疫信息学在预测疫苗位点中起着重要作用。Sarkar等[67]利用反向疫苗学和免疫信息学的方法分别预测了S蛋白和N蛋白的有效抗原表位，并使用不同的佐剂和接头构建了3种可能的疫苗结构，浙江大学医学院和广西大学的两个团队使用相同方法在S蛋白、M蛋白和E蛋白中确定了潜在的B细胞和T细胞表位[68-69]，这些研究可能为未来COVID-19疫苗开发提供初步表位序列。利用这些抗原位点可设计出在安全性和高免疫原性方面都优于传统疫苗的多表位疫苗[70]，具有广阔的应用前景。

由于疫苗作用的特殊性，在研发疫苗时必须考虑多种可能影响因素。据报道自SARS-CoV-2发现至今以来，其序列已逐步发生变化，提示着病毒在人体中不断进化，因此可能会造成病毒毒力的差异[71]，这是在设计疫苗过程中必须考虑到的问题。其次在设计疫苗过程中必须考虑到疫苗可能引发的抗体依赖性增强作用。当抗体促进病毒进入宿主细胞并增强这些细胞中的病毒感染时，就会发生抗体依赖性增强[72-73]。美国明尼苏达大学兽医学院报道抗体依赖性增强作用与抗体的剂量、病毒和抗体的Fc受体的组织特异性表达等因素有关，并且发现如果针对病毒S蛋白的中和单抗不会触发刺突蛋白的构象变化，那么它们就不太可能介导抗体依赖性增强[74]，这为避免抗体依赖性增强的疫苗研发提供了一个可行的建议。疫苗的效力也是设计疫苗时需要考虑的问题，Bao等[75]使用非人灵长类动物模型发现SARS-CoV-2感染后的恒河猴不会出现再次感染，即表明最初的SARS-CoV-2感染对后续的暴露有保护作用。同时冠状病毒疫苗的生产和运输对于预防效果也有重要影响。疫苗的生产除可使用传统系统外，研究显示植物表达系统也有着明显的优势[76]。对于生产的疫苗运输，如SARS-CoV-2在粪便中的发现所证明的那样[77-78]，口服或气雾剂途径接种疫苗可诱导黏膜免疫反应，是COVID-19疫苗免疫的可能方式。  

冠状病毒的疫苗设计主要针对病毒的结构蛋白中的S蛋白。随着SARS-CoV-2病毒株的成功分离以及对该病毒了解程度的不断加深，有多家机构参与多种形式的疫苗研发。目前已有报道我国以腺病毒为载体可表达SARS-CoV-2 S抗原的疫苗以及Monderna公司研制的编码S蛋白的mRNA疫苗mRNA-1273等多项疫苗已进入临床试验阶段。由于疫苗的特殊作用方式，疫苗的研发需要考虑适当的动物模型、抗体依赖性增强作用、DNA疫苗是否可能会与其他病毒重组、自身免疫系统是否影响疫苗作用等多种因素以确保疫苗的安全性和有效性。

5 结语

SARS-CoV-2现已造成全球性感染，针对病毒的诊断、治疗和预防相关的研究也在不断进行。冠状病毒的结构蛋白在病毒的复制感染传播中十分重要，因此本文综述了基于SARS-CoV-2结构蛋白的相关诊疗技术。病毒的免疫学诊断主要针对高免疫原性的S蛋白和N蛋白，病毒的治疗可以通过阻碍S蛋白与受体结合以及直接作用于结构蛋白改变病毒的正常功能，病毒的疫苗研发主要针对S蛋白，因为S蛋白是中和抗体的主要靶点，可诱导高度有效的中和抗体反应。总之，结构蛋白与冠状病毒致病性十分密切，因此在未来的研究中深入了解SARS-CoV-2结构蛋白的结构功能有助于进一步推动病毒高效检出、开发合适药物靶点以及研发高效疫苗等技术的发展。

参考文献（略）
来  源：  杨田田，薛  松，秦  蒙  . 基于新型冠状病毒结构蛋白的诊疗技术的研究进展 [J].  现代药物与临床, 2020, 35(5).