等温扩增技术LAMP和CPA的“孪生兄弟相”

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想了很久，还是决定将LAMP和CPA放在一起进行介绍。主要是因为两者的引物设计都相对比较复杂，但却有着比较相似的工作原理，有异曲同工之妙。

背景：

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LAMP，loop-mediatedisothermal amplification，环介导等温扩增技术

LAMP是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术，它针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物（包括2条内引物和2条外引物），利用具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在65℃条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列， CAP，CrossingPriming Amplification，交叉引物扩增技术CAP是2008年由优思达公司独立研发成功的一种新的核酸恒温扩增技术，也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术。它针对目的基因4或5个区域设计4或者5条特异性引物，利用具有链置换特性的Bst DNA聚合酶、甜菜碱，在63 ℃左右条件下进行高效、快速、高特异地扩增靶序列。

根据交叉引物数量的不同，CPA可分为双交叉扩增（共4条引物=2条交叉引物+2条剥离引物）和单交叉扩增（共5条引物=1条交叉引物+2条剥离引物+2条普通引物）。


LAMP

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设计：

• 6个区域：F1-3, B1-3,其对应互补序列（complementary）F1c-3c，B1c-3c
  5’-F3-F2-F1-B1c-B2c-B3c-3’
  3’-F3c-F2c-F1c-B1-B2-B3-5’
• 两个内引物FIP和BIP
  

         5’-F1c-F2-3’
         5’-B1c-B2-3’

• 两个外引物
  

         F3和B3反应原理：1、上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，引物上的F1c处于游离状态，Bst DNA聚合酶的作用延伸合成带有FIP引物特定序列的互补链；2、外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出新合成的带有FIP引物特定序列的互补链；3、FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构，自我碱基配对形成环状结构，即形成单哑铃状结构模板；4、以此链为模板，下游引物BIP和B3，以上一步骤中形成单哑铃状结构的单链为模板启动反向新链的合成。5、同样的，新合成的单链中B1和B1c互补形成另一端的哑铃状结构；这样就形成的两端为环状的哑铃型单链DNA模板结构；5、哑铃型单链DNA模板结构（包括以上步骤中形成的单哑铃状单链DNA），既可以以自身为模板进行扩增，同时也可以作为引物进行目标靶序列的扩增；6、请记住，只要有游离的3’端存在，就有延伸的可能性。





LAMP原理图来源：Chukwunonso O. Nzelu, et al. PLOS Neglected Tropical Diseases,November 7, 2019

CPA

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CPA-单交叉引物设计：

• 5个区域：
  5’-4s-1s-2s-3s-5s-3’
  3’-4a-1a-2a-3a-5a-5’
• 1个交叉引物
  5’-2a-1s-3’
• 2个剥离引物
  4s和5a
• 2个探针引物
  2a和3a
  

反应原理：1、交叉引物的1s同目标序列1a互补进行新链合成；2、由于交叉引物5‘端的2a游离，会被剥离引物4s在Bst DNA聚合酶作用下进行链置换；3、新合成的带有交叉引物序列的新链就被置换出来；4、探针引物2a和3a以新置换出来的DNA单链为模板继续合成新的模板链，由于5a的存在，可以将以2a和3a为引物合成的新DNA模板进行置换，从而形成多个DNA单链模板，同时也可以作为因为引物存在；5、另外，有交叉引物存在，会在同一单链DNA中引入互补序列2a和2s，从而系统中会存在1+3单链的发夹结构；发夹结构可以在交叉引物存在条件下进行扩增，也可以以2a和3a为引物进行扩增；6、总之，整个反应放大后，或产生2种不同的长度的终产物，即2+1+3+2和2+1+3。


CPA单交叉引物原理图

来源：Gaolian Xu, et al. SCIENTIFIC REPORTS | 2 : 246 | DOI: 10.1038/srep00246

CPA-双交叉引物设计：

• 4个区域：
  5’-3s-1s-2s-4s-3’
  3’-3a-1a-2a-4a-5’
• 2个交叉引物：
  5’-2a-1s-3’
  5’-1s-2a-3’
• 2个剥离引物：
  3s和4a
  

反应原理：1、正反向交叉引物识别模板进行新链合成；2、剥离引物3s和4a，同样在Bst DNA聚合酶作用下进行链置换，将利用交叉引物合成的新模板置换出来；3、两条交叉引物识别带有交叉引物序列的模板进行扩增，这样，模板就会不同重复的被延长带有交叉引物的序列；4、 在同一时间内，可以同时启动多组DNA合成和链置换过程。


CPA双交叉引物原理图 图片来源：网络

小结：LAMP和CPA的异同点

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1、两个系统的引物设计都比较复杂，公认的烧脑；
2、两个系统都可以通过内引物（LAMP）和交叉引物（CPA）实现模板的增长；3、两个系统都使用外围引物（LAMP的外部引物和CPA的剥离引物）在BstDNA聚合酶下进行链置换过程；4、不同点在于引物设计针对的序列排序，导致最终形成哑铃结还是发夹结构+短的DNA模板。

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